Name: Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-07T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Öğrenin fare embriyonik fibroblastlarında elektroporasyon koşullarını optimize etmeyi. Bu yöntem, gen ifadesi çalışmaları için hücre sağlığı ve pasaj numarasının etkisini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1) Hücre hazırlık <ol><li> Yapışık hücrelere kullanırken, trypsinize ve elektroporasyon önce hücreleri toplamak için gereklidir. </li><li> Üç farklı geçit numaraları temsil eden dört fare embriyonik fibroblast (MEF) kültürleri, arasında transfeksiyon karşılaştırmak için, her bir şişesi aşağıdaki gerçekleştirin. </li><li> Hücre kültür ortamı aspire. </li><li> Hücreleri yıkamak için PBS ekleyin. </li><li> PBS çıkarın; hücreleri kapsayacak şekilde yeterli tripsin ve tripsin hücreleri ayırmak için izin vermek için birkaç dakika bekleyin. </li><li> Hücrelerin durumunu doğrulamak için bir mikroskop ile şişeler kontrol hücreleri ayırmak için balon şaplak ve sonra, emin hücreleri tüm müstakil olmak için tekrar şişeyi kontrol edin. </li><li> Ek süre ve gerekirse tekrar bekleyin. </li><li> Tüm hücreleri müstakil sonra, tripsin nötralize etmek için serum içeren medya ekleyin. </li><li> Hücrelerin bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj yoluyla pelet hücreleri (RCF = 300 xg). </li><li> PBS bilinen bir ses supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Hücreleri saymak. </li><li> Uygun hacimli hücre süspansiyonu, deneyler için hücreler (1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu hücreleri de ortalama 150 mcL gerekecektir) gerekli sayıda sağlamak için yeni bir tüpe aktarın . </li><li> Santrifüj hücreleri. </li><li> Gene Verici elektroporasyon 1 x 10 6 hücre / mL bir hücre yoğunluğu elde etmek için tampon uygun hacmi supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li><li> Hücre süspansiyonu plazmid başına mL 20 mg ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li></ol> 2) Elektroporasyon damar kurulum ve elektroporasyon Plaka kurulum ve elektroporasyon <ol><li> Gene Verici MXcell elektroporasyon sisteminin güç modülü takın plaka odası. </li><li> Pipet 150 mcL hücre karışımı ya da 96-kuyu elektroporasyon plaka kuyu içine tampon. </li><li> Plaka odası ve nabız plaka koyun. </li><li> Odasından plaka çıkarın. </li><li> Her bir kuyunun içinde yukarı ve aşağı pipetleme iyi içeriği karıştırın. </li><li> Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın. </li><li> Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak. </li><li> Hücreler 24 saat kurtarmanızı sağlar. </li></ol> Küvet kurulum ve elektroporasyon <ol start="9"><li> ShockPod Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve fiş ™ küvet kamara güç modülü plaka odasına çıkarın. </li><li> Pipet 600 mcL 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvet içine hücre süspansiyonu. </li><li> ShockPod odasına küvet koyun ve elektrik darbe sağlamak. </li><li> Küvet odasından çıkarın. </li><li> Küvet içinde yukarı ve aşağı pipetleme küvet içeriğini karıştırın. </li><li> Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın. </li><li> Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak. </li><li> Hücreler 24 saat geri alalım. </li></ol> 3) Temsilci Sonuçlar Hücreleri transfecting ve onları kurtarmak için izin sonra, flow sitometri kullanarak epifluorescent mikroskopi kullanılarak kantitatif, kalitatif transfeksiyon verimlilik, analiz ve. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. başarıyla electroporated ve şimdi, GFP geninin ifade Hücreler epifluorescent mikroskobu altında görünür. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 faz kontrast altında hücreleri görüntüleme hem transfekte ve untransfected hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bunlar 200V düşük voltaj elektroporasyon darbe maruz kaldılar hücrelerdir. Hücreler yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyük ölçüde konfluent. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3, Epifloresans altında bakış aynı alanda bir dizi hücreleri GFP işaretleyici ifade gösterir, ama bu sadece küçük bir yüzdesi önceki resim görünür hücreleri . <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 250V, faz kontrast altında görülen canlı hücrelerinin toplam sayısı biraz azalır. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Epifloresans altında bir Şekil 5 GFP ifade hücrelerinin sayısının arttığını görebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6, en yüksek voltaj 375V uygulanan, daha az görünür canlı hücreler vardır. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7 Ancak, geri kalan hücreler büyük bir yüzdesi, GFP ifade edilmektedir. Hangi durum optimal deney tasarımı bağlıdır. Bazı deneylerde transfekte hücrelerinin en büyük sayı diğer deneylerde en yüksek yüzde transfeksiyon belki de en iyisi, en uygun olabilir. Biz her koşul altında olumlu GFP ve yüzdeleri hücre yaşla birlikte değişir hücrelerin yüzdesi olarak ilgilenen. Flow sitometri, her farklı elektroporasyon koşullar altında transfeksiyon sonuçları hakkında kantitatif bilgi sağlayabilir. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8 12 elektroporasyon koşulların her birinin altında 5 hücre gösterilen pasajda olumlu GFP hücre yüzdesi. Durumu 12, maksimum transfeksiyon yüzdesi güçlü kare dalga darbe altında yüksek voltaj üstel çürüme darbe, durumu 6 ve% 70 altında yaklaşık% 80, test. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig9.jpg" alt="Şekil 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 9"> Şekil 9 hücrelerin elektroporasyon önce 9 kez geçti, transfeksiyon yüzde genel desen neredeyse aynıdır, ancak çok hafif bir azalma ile transfeksiyon yüzdeleri. <img src="/files/ftp_upload/1662/1662fig10.jpg" alt="Şekil 10" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 10"> Şekil 10 Burada gösterilen geçit genç hücrelere göre transfeksiyon yüzdesinde belirgin bir azalma göstermektedir 13 hücreler, GFP hücrelerinin yüzdeleri. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri yaklaşık yarısı, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanarak önemini gösteren genç hücreleri ne ile elde edildi. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Gene Verici MXcell kullanarak transfecting MEF hücreleri için kullanılan Elektroporasyon Koşullar </td></tr><tr><td> Durumu (1-6) Üstel Bozunma bakliyat, 350 uF, 1000ohm </td><td> Voltaj (V) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 200 </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> 250 </td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td> 300 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 326 </td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td> 350 </td><td></td></tr><tr><td> 6 </td><td> 376 </td><td></td></tr><tr><td> Durumu (7-12) Kare Dalga bakliyat, 2000 uF, 1000 ohm ve 1 darbe </td><td> Voltaj (V) </td><td> Darbe Süresi (ms) </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 200 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 250 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 9 </td><td> 300 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 11 </td><td> 250 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 12 </td><td> 300 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table>

Yazarlar, bu yazıda kullanılan reaktifler ve alet üreten Bio-Rad Laboratories tarafından istihdam edilmektedirler

Bu video makale MXcell elektroporasyon sistemi kolayca MEFS veya diğer birincil hücre hatları için optimal elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. 96-plaka biçimi, pek çok, pek çok ayrı deneyler için ihtiyacını ortadan kaldırabilir aynı anda yapılacak deneysel ya da en iyi duruma getirme koşullarını, çoğaltır için izin verir. Bu yordamı yürütürken, bir, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanmak ve elektroporasyon tampon eşleştirilir elektroporasyon koşulları kullanmak için hatırlamak gerekir.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser&amp;#174; Elektroporasyon Tamponu</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2676</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; Elektroporasyon Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser MXcell&amp;#8482; ShockPod&amp;#8482; Küvet Haznesi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2673</td><td></td></tr><tr><td>ShockPod&amp;#8482; Küvet Hazneli Gene Pulser MXcell&amp;#8482; Elektroporasyon Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2674</td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek verimli primer hücre transfect gen verici mxcell elektroporasyon sistemi

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Elektroporasyon birincil hücre içine plazmid DNA veya siRNA tanıtmak için en etkili yolu olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve Gen Verici elektroporasyon tampon (Bio-Rad), özellikle memeli hücrelerinde ve birincil ve kök hücreleri gibi zor transfect hücreleri, nükleik asitler kolayca transfect için geliştirilmiştir. Biz iyi elektroporasyon koşulları hızla tanımlamak için basit bir deney gerçekleştirmek için nasıl göstereceğiz. Biz bir deney optimizasyonu yapılır aynı zamanda yapılabilir, böylece elektroporasyon koşulları bir dizi yoluyla çeşitli örnekleri çalıştırmak için nasıl göstereceğiz. Biz de en uygun koşulları, aynı elektroporasyon verimliliği korurken, standart elektroporasyon küvetler kullanılabilir 96-iyi elektroporasyon plakaları kullanarak elektroporasyon küvetler elektroporasyon plakalardan geçiş kolaylaştırmak tespit nasıl gösterecektir. Video, elektroporasyon deneyler başarı ya da başarısızlığa yol açabilecek bazı önemli faktörler de ele alınacaktır.

Bu prosedür, Gen Verici MXcell elektroporasyon sistemi hızlı ve kolay bir fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) veya diğer birincil hücreler için en iyi elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. Sorun giderme için dikkat edilmesi gereken noktalar da ilgili video tartışılmıştır.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Elektroporasyonun, plazmid DNA veya siRNA'yı primer hücrelere aktarmanın en etkili yolu olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Pulser...

Bu protokolün genel amacı, fare embriyonik fibroblastları veya mfs kullanılarak primer hücre hatlarının transfeksiyonu için optimum elektroporasyon koşullarını belirlemektir. Örnek olarak, MF hücreleri ve seçilen nükleik asit, tek bir çalışmada birden fazla elektroporasyon koşulunun test edilmesine olanak tanıyan Gene Pulser MX hücre sistemine bağlı 96 kuyucuklu bir elektroporasyon plakasına yüklenir. Optimizasyon deneyleri için hücreler, elektroporasyon sonrası kültüre alınır ve transfeksiyon verimliliği açısından analiz edilir.Epi floresan mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak, gelecekteki transfeksiyonlar için en verimli elektroporasyon koşulları seçilebilir. Merhaba, ben BioRad Laboratuvarları Gen Ekspresyonu Bölümü'nde kıdemli bilim insanı Adam McCoy. Bugün size, primer hücre hatlarını transfekte etmek için en iyi elektroporasyon koşullarını kolayca belirleme prosedürünü göstereceğiz.Bu prosedürü laboratuvarımızda, bu hücrelerdeki gen ekspresyonunu incelemek için kullanıyoruz. Bugün, mes veya fare embriyonik fibroblastlarının üç farklı pasaj numarasına sahip kültürlerini kullanacağım. Farklı pasaj numarasına sahip kültürleri iki nedenden dolayı kullanıyorum.İlk olarak, hücre sağlığının ne kadar önemli olduğunu göstereceğim; primer hücre hatlarında, kültürde geçirilen sadece birkaç ek gün bile transfeksiyon verimliliğinde fark yaratabilir. İkinci olarak, yaşlı hücrelerde transfeksiyon verimliliği düşse bile, en iyi koşulların belirleme sürecinin aynı olduğunu göstermek istiyorum. Sizin deneyiniz muhtemelen farklı yaşlardaki hücreleri içermeyecektir.Kendi deneysel tasarımınızla aynı prosedürü izleyebilirsiniz. Gen ekspresyonunu kontrol ve işlem görmüş hücreler arasında karşılaştırmak istiyorsanız, öncelikle en uygun koşulları belirleyebilir ve ardından tespit ettiğiniz bu koşulları kullanarak deneyinizi gerçekleştirebilirsiniz. Alternatif olarak, optimizasyon ve deney aşamalarını birlikte yürütebilirsiniz.Bugün göstereceğim şekilde, transfeksiyon verimliliğini akış sitometrisi ile incelemek için GFP kodlayan bir plazmit kullanacağım. Ancak, irna aktarımı yapmak ve gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonuna bakmak gibi farklı bir işlem yapsanız dahi, elektroporasyon prosedürü aynı kalacaktır. Öyleyse başlayalım.Bu protokolde kullanılan fare embriyonik fibroblastları (MEFs), adherent hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücrelerle çalışmadaki ilk adım, tripsinizasyonu içeren standart doku kültürü protokollerini kullanarak onları flask tabanından ayırmaktır. Hücreler flasktan ayrıldıktan sonra, tripsini serum içeren besiyeri ile nötralize edin ve hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere toplayın.Hücreler toplandıktan sonralepelenecek şekilde santrifüjleyin. Bilinen bir hacimdeki PBS içinde yeniden süspanse edilerek yıkanmalıdırlar. Tamamen yeniden süspanse edildikten sonra, elektroporasyon deneyleri için mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonuna ihtiyaç duyulacağını bilerek hücreleri sayın.Hücre sayımına göre uygun hücre sayısını hesaplayın ve bunları temiz bir tüpe aktarın. Hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Ardından üst fazı dikkatlice uzaklaştırın.Hücreleri mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonunda elektroporasyon tamponu ile yeniden süspanse edin ve mililitre başına 20 mikrogram plazmid ekleyin. Plakalar, sütunları 1'den 12'ye ve satırları A'dan H'ye kadar etiketlenmiş 96 kuyucuğa ayrılmıştır; her dört kuyucukluk set veya kuyucuk seti, bir çift elektrot plakası paylaşır, böylece bu kuyucuklardaki hücreler aynı darbe etkisine maruz kalır. Örneğin, 1A, 1B, 1C ve 1D hücreleri tek bir kuyucuk setinde elektriksel olarak bağlantılıdır ve tamamı aynı darbeyi alır.Sıradaki dörtlü kuyucuk seti olan 2A, 2B, 2C ve 2D, protokol başlatıldığında ikinci palsi alacaktır; parametreler aynı olsa bile, 96 kuyucuklu elektroporasyon plakası plakanın üst ve alt yarısı bölünecek şekilde ayarlanmıştır. Bu nedenle plakanın alt kısmındaki 1E, 1F, 1G ve 1H kuyucuklarının tamamı tek bir pals almıştır. Ancak bu, üst kısımdaki 1A, 1B, 1C ve 1D kuyucuklarının aldığı palsten farklıdır.Bu deneyde, plakanın sadece yarısı kullanılacaktır. Her kuyu setinin ilk üç kuyusu farklı yaşlardaki hücreleri içermektedir. Üst sıradaki A sırasındaki hücreler beş kez pasajlanmıştır.B sırasındaki hücreler dokuz kez, C sırasındaki hücreler ise 13 kez pasajlanmıştır. D sırası, elektroporasyon öncesinde yalnızca elektroporasyon tamponu içermektedir. Ayarların doğru olduğundan emin olmak için protokolünüzü kontrol etmeniz faydalı olacaktır.Bu protokol, ardından altı adet kare dalga darbesi gelecek şekilde altı adet üstel sönümlü darbe uygulayacaktır. Üstel sönümlü darbeler 200 volt'tan 450 volt'a yükselmekte olup tamamında yalnızca 350 micro ferrets kullanılmaktadır. Bu durum, kullanılan gen darbesi veya elektroporasyon tamponunun düşük direncinden kaynaklanmaktadır.Kare dalga darbeleri hem voltaj hem de darbe süresi açısından değişkenlik gösterir. Cihazın kapasitans ayarının, elektroporasyon karışımının iletkenliğine uygun hale getirilmesi gerekir. Elektroporasyon için DMEM gibi daha yüksek dirençli bir tampon kullanılıyorsa, aynı voltaj aralığı kullanılabilir ancak eksponansiyel sönümleme darbeleri için 950 µF gibi daha yüksek bir kapasitans seçilmelidir.Kullandığınız tamponun optimal kapasitansı bilinmiyorsa, test ettiğiniz elektroporasyon koşullarında kapasitansı da değiştirmeniz gerekecektir. Bir sonraki adım, bu deney için kullanılan her bir kuyucuğa 150 µL hücre plazmid karışımı yüklemektir. Kullanılan her kuyucuk setinin dördüncü kuyucuğu elektroporasyon tamponu ile doldurulur.Plaka yüklendikten sonra, plakayı MXL plaka bölmesine yerleştirin ve kapağı kapatın. Ardından hücreleri elektropore etmek için pulse düğmesine basın. Elektroporatör, seçilen protokolde belirtilen koşullara göre ayarlanan elektrik palslarını her bir kuyucuğa sırayla iletir.Tüm hücrelerin elektroporasyonunun yapılması birkaç saniye sürer. Puls işlem tamamlandığında, plakayı plaka haznesi düzenekleğinden çıkarın. Her bir kuyuktaki hücreleri, önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren bir kültür kabına aktarın.Bu hücreler, %10 FBS ile desteklenmiş DMEM içerisinde büyütülmektedir; elektropore edilmemiş kontrol örnekleri, kalan hücre-plazmid karışımından alınır ve önceden ısıtılmış kültür içeren kültür kaplarına eklenir. Elektropore edilen hücreler için kullanılanla aynı bileşime sahip besiyeri kullanılır. Son olarak, kaplar dairesel hareketlerle çalkalanır.Ardından, transfeksiyon verimliliğini analiz etmeden ve deneyiniz için hangi elektroporasyon koşullarının en iyisi olduğunu belirlemeden önce, hücreleri dağıtmak için plakaya hafifçe vurun ve plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin. Optimal elektroporasyon koşulları belirlendikten sonra, gelecek deneyler için iki elektroporasyon yöntemi seçeneği mevcuttur. Araştırmacı, hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda işlemeye devam edebilir veya hücreleri her seferinde bir örnek olacak şekilde küvetlerde işleyebilir.Küvetler her seferinde yalnızca bir örnek alabilir ve 96 kuyucuklu plakaların bir kuyucuğu için gereken hacmin dört katı hacim gerektirir; ancak sadece az sayıda örneğe ihtiyaç duyulduğunda, tekil küvetler daha düşük maliyetlidir ve kullanımı kolaydır. Gene Pulse veya MX hücre sistemi, plakalar ve küvetlerde aynı elektroporasyon ayarlarının kullanılabileceği şekilde tasarlanmıştır. Plaka haznesi yerine, küvetler için mxl şok podunu kullanın.Plaka haznesini cihazın arkasından çıkarın ve şok podunu takın. Şok podu yalnızca kuyucuk setleri A, B, C, D için programlanmış darbeyi ilettiğinden, farklı bir program seçilmesi gerekebilir. Daha önce kaydedilmiş bir programı seçmek için ana sayfa düğmesine basın.Ardından üç numaralı seçenek olan kullanıcı protokollerini seçin. Halihazırda doğru kullanıcı klasöründeyseniz, kullanıcı protokollerini seçmek için enter tuşuna basın ve aşağı kaydırın. Doğru programı vurgulamak için, o programı seçmek üzere enter tuşuna basın.Cihaz şu anda hazırdır. Program seçildikten sonra küvetleri hazırlayın. Plazmid ve MEF karışımı, daha önce gösterildiği şekilde hazırlanır.Her 0,4 santimetrelik kuyuya, 96 kuyucuklu plakalardaki tüm bir kuyu seti için kullanılan hacmin aynısını yükleyin. Bir kuyu seti dört kuyucuktan oluştuğu ve kuyucuk başına 150 mikrolitre tampon çözelti veya hücre karışımı kullanıldığı için, her kuyuya 600 mikrolitre plazmid hücre karışımı ekleyin.Ardından veti şok poduna yerleştirin, hücrelere elektrik şoku vermek için pulse düğmesine basın. Elektroporasyondan sonra plaka yöntemiyle devam edin; hücreleri karıştırın, ardından alikotları önceden ısıtılmış besiyeri ile doldurulmuş hücre kültürü plakalarına aktarın ve kontrol grubu belirleyin. Elektropore edilmeyen kuyucukları dahil ederek plakayı dairesel hareketlerle sallayın ve hafifçe vurun.Ardından, hücreleri transfekte edip iyileşmelerine izin verdikten sonra transfeksiyon verimliliğini analiz etmeden önce, 37 °C'de ve %5 karbon dioksit ortamında 24 saat boyunca iyileşmeye bırakın. Transfeksiyon verimliliğini, epi floresan mikroskopi kullanarak kalitatif olarak ve akış sitometrisi kullanarak kantitatif olarak analiz edin; başarıyla elektropore edilmiş ve şu an GFP genini eksprese eden hücreler, epi floresan mikroskopi altında yeşil görünür, burada tipik bir başarılı sonuç gösterilmektedir. Hücrelerin faz kontrast altında incelenmesi, hem transfekte edilmiş hem de transfekte edilmemiş hücrelerin görüntülenmesini sağlar.Burada, 200 voltluk en düşük voltajlı elektroporasyon pulsuna maruz bırakılan hücreler gösterilmiştir. Yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle hücreler büyük oranda konfluenttir. Aynı görüş alanı epi-floresan altında incelendiğinde, bir dizi hücrenin GFP markörünü eksprese ettiği görülmektedir; ancak bunlar, 250 voltluk önceki görüntüde görülen hücrelerin yalnızca küçük bir yüzdesini oluşturmaktadır.Faz kontrastında görülen toplam canlı hücre sayısı, epi floresan altında hafifçe azalmaktadır. Uygulanan en yüksek voltaj olan 375 volt değerinde GFP ekspres eden hücre sayısının arttığı görülmektedir. Daha az canlı hücre görünür durumda olsa da, kalan hücrelerin büyük bir yüzdesi GFP eksprese etmektedir.Hangi koşulun optimal olduğu deneysel tasarıma bağlıdır. Bazı deneylerde, transfekte edilen hücre sayısının en yüksek olması optimal olabilir. Diğer deneylerde ise en yüksek transfeksiyon yüzdesi en iyisi olabilir.Her bir koşul altında GFP pozitif olan hücrelerin yüzdesi ve bu yüzdelerin hücre yaşı akışıyla nasıl değiştiği ile ilgileniyoruz. Sitometri, farklı elektroporasyon koşullarının her biri altındaki transfeksiyon sonuçları hakkında kantitatif bilgi sağlayabilir. Burada, pasajdaki GFP pozitif hücrelerin yüzdesi gösterilmiştir.Beş hücre. 12 elektroporasyon koşulunun her birinde, maksimum transfeksiyon yüzdesi, en yüksek voltajlı eksponansiyel sönümleme altında yaklaşık %80 idi. Darbe koşulu altı ve 70, hücrelerin elektroporasyondan önce dokuz kez pasajlandığı, test edilen en güçlü kare dalga darbe koşulu olan koşul 12 altında gerçekleşmiştir.Transfeksiyon yüzdesi genel kalıbı neredeyse aynıdır, ancak gösterilen transfeksiyon yüzdelerinde çok hafif bir azalma söz konusudur. Genç hücrelere kıyasla transfeksiyon yüzdesinde belirgin bir azalma gösteren pasaj 13 hücrelerindeki GFP hücre yüzdeleri burada verilmiştir. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri, genç hücrelerle elde edilenlerin yaklaşık yarısı kadardı; bu durum, izolasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede sağlıklı hücrelerin kullanılmasının önemini kanıtlamaktadır.Size, MAPK veya diğer primer hücre hatları için optimal elektroporasyon koşullarını belirlemek amacıyla MXL elektroporasyon sisteminin nasıl kullanılacağını göstermiş oldum. Bu prosedürü gerçekleştirirken, izolasyondan hemen sonra sağlıklı hücreler kullanmayı ve seçilen elektroporasyon koşullarının elektroporasyon tamponu ile uyumlu olduğundan emin olmayı unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

using-gene-pulser-mxcell-electroporation-system-to-transfect-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Darbe uygulama sırasında elektrik alanın yönü değiştiğinde elektroporasyon Gen transfeksiyon yaklaşık iki kat artar, hücre canlılığı etkilenen değildir. Gen transfeksiyon artış hücre içine DNA giriş için yetkili yapılır membran alanı artışı neden olur.

Elektrik Bakliyat Uygulama sırasında Yön ve Elektrik Alan yönelimi değiştirme Plazmid Gen Transferi artırır In vitro</em

Bu video, floresan protein kodlayan plazmit DNA'sını fare birincil serebellar granül hücre öncülerine sokan elektroporasyon tekniğini göstermektedir.

Elektroporasyon Aracılı İn Vitro Gen İletimi: Floresan Raportör Protein Kodlayan Plazmitleri Kültürlenmiş Hücrelere Sokmak İçin Bir Elektrik Darbe Tekniği

Yeni nesil elektroporasyon, gen ekspresyonunu ve hücre davranışını değiştirmek için insan Th17 hücrelerini küçük RNA'larla transfekte etmek için etkili bir yöntemdir.

Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Uyuyan Güzel (SB) transpozon sistemini kullanarak pigment epitel türevi faktörü (PEDF) kodlayan gen ile elektroporasyon yoluyla primer insan pigment epitel hücrelerini transfekte etmek için bir protokol geliştirdik. Başarılı transfeksiyon, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), immünoblotlama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile gösterilmiştir.

Uyuyan Güzel Transpozon Sistemi Kullanılarak Primer İnsan Pigment Epitel Hücrelerinin Elektroporasyon Tabanlı Genetik Modifikasyonu

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

Bu protokol, in vitro olarak bir araya getirilen ve elektroporasyon yoluyla iletilen Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksleri kullanılarak fare kemik iliği türevi makrofajlarda genom düzenleme prosedürünü açıklar.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Homoloji aracılı uç birleştirme (HMEJ) DNA onarım yolu yoluyla birincil insan T hücrelerinde büyük, multisistronik yapıların yüksek verimli hedefli knock-in'ini elde etmek için CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanmak için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu cGMP'ye uyarlanabilir protokolle tasarlanan T hücreleri, mükemmel hücre genişlemesi, sitotoksisite ve sitokin üretimini korur.

Büyük DNA Şablonlarının Homoloji Aracılı Uç Birleştirme Hedefli Entegrasyonu Yoluyla Birincil İnsan T Hücrelerinin Viral Olmayan Mühendisliği

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Öğrenin fare embriyonik fibroblastlarında elektroporasyon koşullarını optimize etmeyi. Bu yöntem, gen ifadesi çalışmaları için hücre sağlığı ve pasaj numarasının etkisini değerlendirir.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Daha fazla video keşfet