Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Bu protokolün genel amacı, fare embriyonik, fibroblastlar veya mfs kullanarak birincil hücre hatlarını kesmek için optimum elektroporasyon koşullarını belirlemektir. Örnek olarak, MF hücreleri ve tercih edilen nükleik asit, gen Pulser MX hücre sistemine bağlı 96 kuyulu bir elektroporasyon plakasına yüklenir ve bu da tek bir çalışmada çoklu elektroporasyon koşullarının test edilmesine olanak tanır. Optimizasyon deneyleri için, hücreler kültürlenir, elektroporasyon sonrası ve transfeksiyon verimliliği için analiz edilir.

Epi floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak, gelecekteki transfekt için en verimli elektroporasyon koşulları seçilebilir. Merhaba, ben Adam McCoy, BioRad Laboratuvarları'ndaki Gen İfadesi Bölümü'nde kıdemli bilim adamıyım. Bugün size, birincil hücre hatlarını kesmek için en iyi elektroporasyon koşullarını kolayca tanımlamak için bir prosedür göstereceğiz.

Bu hücrelerdeki gen ekspresyonunu incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Bugün mes veya fare embriyonik fibroblastlarının üç farklı geçiş numarasını kullanacağım. İki nedenden dolayı farklı geçiş numarası kültürleri kullanıyorum.

İlk olarak, hücre sağlığının ne kadar önemli olduğunu göstereceğim Birincil hücre hatlarında, kültürde sadece birkaç ekstra gün bile transfeksiyon verimliliğinde bir fark yaratabilir. İkinci olarak, en iyi koşulları belirleme sürecinin, transfeksiyonun etkinliği eski hücrelerle birlikte düşse bile, aynı olduğunu göstermek istiyorum. Deneyiniz muhtemelen farklı yaşlardaki hücreleri içermeyecektir.

Aynı prosedürü kendi deneysel tasarımınız için de uygulayabilirsiniz. Gen ekspresyonu ile kontrol ve tedavi edilen hücreleri karşılaştırmak istiyorsanız, önce en iyi koşulları bulabilir ve ardından belirlediğiniz koşulları kullanarak deneyinizi yapabilirsiniz. Ya da optimizasyonunuzu yapabilir ve birlikte deneyebilirsiniz.

Bugün göstereceğim gibi, akış sitometrisi ile transfeksiyon verimliliğine bakmak için bir GFP kodlama plazmidi kullanacağım. Ancak elektroporasyon prosedürü, irna'yı tanıtmak ve gerçek zamanlı PCR ile gen ifadesine bakmak gibi farklı bir şey yapıyor olsanız bile aynı olacaktır. Öyleyse başlayalım.

Bu protokolde kullanılan fare embriyonik fibroblastları veya mets yapışık hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücrelerle çalışmanın ilk adımı, tripsin içeren standart doku kültürü protokollerini kullanarak onları şişenin altından kaldırmaktır. Izasyon. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, tripsini serum içeren ortamla nötralize edin ve hücreleri 50 mililitrelik konik tüplerde toplayın.

Santrifüj toplandıktan sonra, hücreler peletlendikten sonra hücreler. Resüs ile yıkanmalı ve bilinen bir PBS hacminde süspanse edilmelidir. Tamamen yeniden askıya alındıktan sonra, elektroporasyon deneyleri için mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonuna ihtiyaç duyulacağını bilerek hücreleri sayın.

Hücre sayısına göre uygun hücre sayısını hesaplayın ve bunları temiz bir tüpe aktarın. Santrifüj, hücreleri peletlemek için daha fazlasını ister. Sonra tırnağı dikkatlice çıkarın.

Hücreleri elektroporasyon tamponunda mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonuna yeniden askıya alın ve plazmidin mililitresi başına 20 mikrogram ekleyin. Plakalar, bir ila 12 arasında etiketlenmiş sütunlar ve sekiz ila H sıraları arasında 96 oyuğa bölünür, her biri dört kuyucuk seti veya kuyu seti bir çift elektrot plakasını paylaşır, böylece bu kuyucuklardaki hücreler aynı darbeyi yaşar. Örneğin, bir A, bir B, bir C ve 1D hücreleri tek bir kuyu setine elektriksel olarak bağlanır ve hepsi aynı darbeyi alır.

Bir sonraki dört kuyu seti, iki, A, B, C ve D, protokol başlatıldığında ikinci darbeyi alacaktır, parametreler aynı olsa bile, 96 kuyulu elektroporasyon plakası da plakanın üst ve alt yarısı bölünecek şekilde ayarlanmıştır. Böylece, plakanın altındaki bir E, bir F, bir G ve bir H kuyularının tümü bir darbe aldı. Ancak üstteki bir, A, B, C ve D kuyularının aldığı nabızdan farklıdır.

Bu deneyde, plakanın sadece yarısı kullanılacaktır. Her kuyu setinin ilk üç kuyucuğu farklı yaşlarda hücreler içerir. En üst satır A satırındaki hücreler beş kez geçilmiştir.

B sırasındaki hücreler dokuz kez ve C sırasındaki hücreler 13 kez geçilmiştir. D satırı, yalnızca elektroporasyondan önce elektroporasyon tamponu içerir. Ayarların doğru olduğundan emin olmak için protokolünüzü kontrol etmek iyi bir fikirdir.

Bu protokol, altı üstel bozunma darbesi ve ardından altı kare dalga darbesi verecektir. Üstel bozunma darbeleri 200 volttan 450 volta çıkar ve hepsi sadece 350 mikro gelincik kullanır. Genin düşük direnci nedeniyle, nabız veya elektroporasyon tamponu kullanılır.

Kare dalga darbeleri hem voltaj hem de darbe süresi bakımından farklılık gösterir. Cihazın kapasitans ayarının, elektroporasyon karışımının iletkenliği ile eşleştirilmesi gerekir. DMEM gibi elektroporasyon için daha yüksek bir direnç tamponu kullanılıyorsa, aynı voltaj aralığı kullanılabilir, ancak üstel bozunma darbeleri için 950 mikro gelincik gibi daha büyük bir kapasitansla.

Kullanmakta olduğunuz tamponun optimal kapasitansı bilinmiyorsa, test ettiğiniz elektroporasyon koşullarında da kapasitansı değiştirmeniz gerekecektir. Bir sonraki adım, bu deney için kullanılan her bir kuyucuğa 150 mikrolitre hücre plazmit karışımı yüklemektir. Kullanılan her kuyu setinin dördüncü kuyusu elektroporasyon tamponu ile doldurulur.

Plakayı yükledikten sonra MXL plaka haznesine yerleştirin ve kapağı kapatın. Sonra hücreleri yemek için nabız tuşuna basın. Atör, elektrik darbelerini, seçilen protokolde belirtilen koşullara göre ayarlanan her bir kuyuya sırayla iletir.

Tüm hücrelere elektro dua etmek birkaç saniye sürer. Nabız tamamlandığında, plakayı gönderilen plaka haznesi karışımından çıkarın. Hücreleri her bir oyuktan ön ısıtma kültür ortamı içeren bir kültür kabına aktarın.

Bu mes DMEM'de büyütülür, %10 FBS kontrol ile desteklenir, elektroporasyon yapılmamış numuneler kalan hücre plazmid karışımından alınır ve savaş öncesi kültürü içeren kültür kaplarına eklenir. Elektroporasyonlu hücrelerle kullanılanla aynı bileşime sahip ortam. Sonunda girdap.

Ardından, transfeksiyon verimliliğini analiz etmeden ve deneyiniz için hangi elektroporasyon koşullarının en iyi olduğunu belirlemeden önce, 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirmeden önce hücreleri dağıtmak için plakaya dokunun. Optimum elektroporasyon koşulları belirlendikten sonra, gelecekteki deneyler için iki elektroporasyon yöntemi seçeneği vardır. Araştırmacı ya 96 oyuklu plakadaki hücreleri yemeye devam edebilir ya da her seferinde bir örnek olan küvetlerdeki hücreleri yiyebilir.

Küvetler bir seferde yalnızca bir numune yiyebilir ve 96 kuyulu plakanın bir kuyusu için gereken hacmin dört katını gerektirir, ancak tek tek küvetler daha ucuzdur ve yalnızca az sayıda numuneye ihtiyaç duyulduğunda kullanımı kolaydır. Gen darbesi veya MX hücre sistemi, bu sefer plakalarda ve küvetlerde aynı elektroporasyon ayarlarının kullanılabilmesi için tasarlanmıştır. Plaka haznesi yerine, küvetler için mxl şok bölmesini kullanın.

Plaka bölmesini cihazın arkasından çıkarın ve şok bölmesini prize takın. Şok podu sadece iyi ayarlanmış A, B, C, D biri için programlanan darbeyi verdiğinden, farklı bir programın seçilmesi gerekebilir. Önceden kaydedilmiş bir programı seçmek için home tuşuna basın.

Ardından üç seçenek olan kullanıcı protokollerini seçin. Zaten doğru kullanıcı klasöründeyseniz, kullanıcı protokollerini seçmek için enter tuşuna basın ve aşağı kaydırın. Doğru programı vurgulamak için, o programı seçmek üzere enter tuşuna basın.

Enstrüman artık hazır. Artık program seçildiğine göre, küvetleri ayarlayın. Plazmid ve MEF'lerin karışımı, daha önce gösterildiği gibi hazırlanır.

Her 0,4 santimetrelik veterineri, tüm kuyu seti için kullanılanla aynı hacimde yükleyin. 96 kuyu plakasında. Bir kuyu seti dört kuyu olduğundan ve vete başına 600 mikrolitre plazmit hücre karışımında kuyu başına 150 mikrolitre tampon veya hücre karışımı kullanıldığından.

Daha sonra veterineri şok bölmesi odasına yerleştirin, elektrik şokunu hücrelere iletmek için darbeye basın. Elektroporasyondan sonra, plaka yöntemi karışımında olduğu gibi devam edin, hücreler daha sonra alikotları ön ısıtma ortamı kontrol seti ile doldurulmuş hücre kültürü plakalarına aktarır. Elektroporasyonlu olmayan kuyular plakayı döndürür ve musluk açar.

Daha sonra, hücreleri kestikten ve iyileşmelerine izin verdikten sonra transfeksiyon verimliliğini analiz etmeden önce hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca iyileşmeye bırakın. Epi floresan mikroskobu kullanarak transfeksiyon verimliliğini kalitatif olarak ve başarılı bir şekilde elektropore edilmiş ve şimdi GFP genini epi floresan mikroskobu altında yeşil görünen akış sitometrisi hücrelerini kullanarak kantitatif olarak analiz edin, burada gösterilen tipik bir başarılı sonuçtur. Hücrelerin faz kontrastı altında görüntülenmesi, hem transfekte edilmiş hem de rezeke edilmemiş hücrelerin görselleştirilmesine izin verir.

Burada, 200 voltta en düşük voltajlı elektroporasyon darbesine maruz kalan hücreler gösterilmektedir. Hücreler, yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyük ölçüde birleşiktir. Epi floresan altındaki aynı görüş alanı, bir dizi hücrenin GFP işaretçisini ifade ettiğini gösterir, ancak bunlar, önceki görüntüde 250 voltta görünen hücrelerin yalnızca küçük bir yüzdesidir.

Faz kontrastı altında görülen toplam canlı hücre sayısı, epi floresan altında biraz azalır. 375 volt uygulanan en yüksek voltajda GFP eksprese eden hücrelerin sayısının arttığını görebiliriz. Görünür daha az canlı hücre vardır, ancak kalan hücrelerin büyük bir yüzdesi GFP'yi ifade etmektedir.

Hangi koşulun optimal olduğu deneysel tasarıma bağlıdır. Bazı deneylerde, en fazla transfekte edilmiş hücre sayısı optimal olabilir. Diğer deneylerde, en yüksek transfeksiyon yüzdesi en iyisi olabilir.

Her koşulda GFP pozitif olan hücrelerin yüzdesi ve yüzdelerin hücre yaşı akışına göre nasıl değiştiği ile ilgileniyoruz. Sitometri, farklı elektroporasyon koşullarının her biri altında transfekt sonuçlar hakkında nicel bilgi sağlayabilir. Burada, pasajda GFP pozitif olan hücrelerin yüzdesi gösterilmektedir.

Beş hücre. 12 elektroporasyon koşulunun her biri altında, maksimum transfeksiyon yüzdesi, en yüksek voltaj üstel bozunması altında yaklaşık% 80 idi. Darbe koşulu altı ve 70, en güçlü kare dalga nabız testi koşulu 12 altında, hücreler elektroporasyondan önce dokuz kez geçirildi.

Genel transfeksiyon yüzdesi modeli hemen hemen aynıdır, ancak gösterilen transfeksiyon yüzdelerinde çok hafif bir azalma vardır. Burada, genç hücrelere göre transfect yüzdesinde belirgin bir azalma gösteren geçiş 13 hücresindeki GFP hücrelerinin yüzdeleri verilmiştir. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri, genç hücrelerle elde edilenin yaklaşık yarısı kadardı ve bu da sağlıklı hücrelerin izolasyondan mümkün olan en kısa sürede kullanılmasının önemini gösterdi.

Az önce size, elektro problama haritaları veya diğer birincil hücre hatları için en uygun koşulları belirlemek için MXL elektroporasyon sistemini nasıl kullanacağınızı gösterdim. Bu prosedürü yaparken, izolasyondan mümkün olan en kısa sürede sağlıklı hücreleri kullanmayı ve elektroporasyon tamponuna uygun elektroporasyon koşullarını kullanmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.