Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Bu protokolün genel amacı, fare embriyonik fibroblastları veya mfs kullanılarak primer hücre hatlarının transfeksiyonu için optimum elektroporasyon koşullarını belirlemektir. Örnek olarak, MF hücreleri ve seçilen nükleik asit, tek bir çalışmada birden fazla elektroporasyon koşulunun test edilmesine olanak tanıyan Gene Pulser MX hücre sistemine bağlı 96 kuyucuklu bir elektroporasyon plakasına yüklenir. Optimizasyon deneyleri için hücreler, elektroporasyon sonrası kültüre alınır ve transfeksiyon verimliliği açısından analiz edilir.

Epi floresan mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak, gelecekteki transfeksiyonlar için en verimli elektroporasyon koşulları seçilebilir. Merhaba, ben BioRad Laboratuvarları Gen Ekspresyonu Bölümü'nde kıdemli bilim insanı Adam McCoy. Bugün size, primer hücre hatlarını transfekte etmek için en iyi elektroporasyon koşullarını kolayca belirleme prosedürünü göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, bu hücrelerdeki gen ekspresyonunu incelemek için kullanıyoruz. Bugün, mes veya fare embriyonik fibroblastlarının üç farklı pasaj numarasına sahip kültürlerini kullanacağım. Farklı pasaj numarasına sahip kültürleri iki nedenden dolayı kullanıyorum.

İlk olarak, hücre sağlığının ne kadar önemli olduğunu göstereceğim; primer hücre hatlarında, kültürde geçirilen sadece birkaç ek gün bile transfeksiyon verimliliğinde fark yaratabilir. İkinci olarak, yaşlı hücrelerde transfeksiyon verimliliği düşse bile, en iyi koşulların belirleme sürecinin aynı olduğunu göstermek istiyorum. Sizin deneyiniz muhtemelen farklı yaşlardaki hücreleri içermeyecektir.

Kendi deneysel tasarımınızla aynı prosedürü izleyebilirsiniz. Gen ekspresyonunu kontrol ve işlem görmüş hücreler arasında karşılaştırmak istiyorsanız, öncelikle en uygun koşulları belirleyebilir ve ardından tespit ettiğiniz bu koşulları kullanarak deneyinizi gerçekleştirebilirsiniz. Alternatif olarak, optimizasyon ve deney aşamalarını birlikte yürütebilirsiniz.

Bugün göstereceğim şekilde, transfeksiyon verimliliğini akış sitometrisi ile incelemek için GFP kodlayan bir plazmit kullanacağım. Ancak, irna aktarımı yapmak ve gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonuna bakmak gibi farklı bir işlem yapsanız dahi, elektroporasyon prosedürü aynı kalacaktır. Öyleyse başlayalım.

Bu protokolde kullanılan fare embriyonik fibroblastları (MEFs), adherent hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücrelerle çalışmadaki ilk adım, tripsinizasyonu içeren standart doku kültürü protokollerini kullanarak onları flask tabanından ayırmaktır. Hücreler flasktan ayrıldıktan sonra, tripsini serum içeren besiyeri ile nötralize edin ve hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere toplayın.

Hücreler toplandıktan sonralepelenecek şekilde santrifüjleyin. Bilinen bir hacimdeki PBS içinde yeniden süspanse edilerek yıkanmalıdırlar. Tamamen yeniden süspanse edildikten sonra, elektroporasyon deneyleri için mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonuna ihtiyaç duyulacağını bilerek hücreleri sayın.

Hücre sayımına göre uygun hücre sayısını hesaplayın ve bunları temiz bir tüpe aktarın. Hücreleri çöktürmek için santrifüjleyin. Ardından üst fazı dikkatlice uzaklaştırın.

Hücreleri mililitrede 1 milyon hücre konsantrasyonunda elektroporasyon tamponu ile yeniden süspanse edin ve mililitre başına 20 mikrogram plazmid ekleyin. Plakalar, sütunları 1'den 12'ye ve satırları A'dan H'ye kadar etiketlenmiş 96 kuyucuğa ayrılmıştır; her dört kuyucukluk set veya kuyucuk seti, bir çift elektrot plakası paylaşır, böylece bu kuyucuklardaki hücreler aynı darbe etkisine maruz kalır. Örneğin, 1A, 1B, 1C ve 1D hücreleri tek bir kuyucuk setinde elektriksel olarak bağlantılıdır ve tamamı aynı darbeyi alır.

Sıradaki dörtlü kuyucuk seti olan 2A, 2B, 2C ve 2D, protokol başlatıldığında ikinci palsi alacaktır; parametreler aynı olsa bile, 96 kuyucuklu elektroporasyon plakası plakanın üst ve alt yarısı bölünecek şekilde ayarlanmıştır. Bu nedenle plakanın alt kısmındaki 1E, 1F, 1G ve 1H kuyucuklarının tamamı tek bir pals almıştır. Ancak bu, üst kısımdaki 1A, 1B, 1C ve 1D kuyucuklarının aldığı palsten farklıdır.

Bu deneyde, plakanın sadece yarısı kullanılacaktır. Her kuyu setinin ilk üç kuyusu farklı yaşlardaki hücreleri içermektedir. Üst sıradaki A sırasındaki hücreler beş kez pasajlanmıştır.

B sırasındaki hücreler dokuz kez, C sırasındaki hücreler ise 13 kez pasajlanmıştır. D sırası, elektroporasyon öncesinde yalnızca elektroporasyon tamponu içermektedir. Ayarların doğru olduğundan emin olmak için protokolünüzü kontrol etmeniz faydalı olacaktır.

Bu protokol, ardından altı adet kare dalga darbesi gelecek şekilde altı adet üstel sönümlü darbe uygulayacaktır. Üstel sönümlü darbeler 200 volt'tan 450 volt'a yükselmekte olup tamamında yalnızca 350 micro ferrets kullanılmaktadır. Bu durum, kullanılan gen darbesi veya elektroporasyon tamponunun düşük direncinden kaynaklanmaktadır.

Kare dalga darbeleri hem voltaj hem de darbe süresi açısından değişkenlik gösterir. Cihazın kapasitans ayarının, elektroporasyon karışımının iletkenliğine uygun hale getirilmesi gerekir. Elektroporasyon için DMEM gibi daha yüksek dirençli bir tampon kullanılıyorsa, aynı voltaj aralığı kullanılabilir ancak eksponansiyel sönümleme darbeleri için 950 µF gibi daha yüksek bir kapasitans seçilmelidir.

Kullandığınız tamponun optimal kapasitansı bilinmiyorsa, test ettiğiniz elektroporasyon koşullarında kapasitansı da değiştirmeniz gerekecektir. Bir sonraki adım, bu deney için kullanılan her bir kuyucuğa 150 µL hücre plazmid karışımı yüklemektir. Kullanılan her kuyucuk setinin dördüncü kuyucuğu elektroporasyon tamponu ile doldurulur.

Plaka yüklendikten sonra, plakayı MXL plaka bölmesine yerleştirin ve kapağı kapatın. Ardından hücreleri elektropore etmek için pulse düğmesine basın. Elektroporatör, seçilen protokolde belirtilen koşullara göre ayarlanan elektrik palslarını her bir kuyucuğa sırayla iletir.

Tüm hücrelerin elektroporasyonunun yapılması birkaç saniye sürer. Puls işlem tamamlandığında, plakayı plaka haznesi düzenekleğinden çıkarın. Her bir kuyuktaki hücreleri, önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren bir kültür kabına aktarın.

Bu hücreler, %10 FBS ile desteklenmiş DMEM içerisinde büyütülmektedir; elektropore edilmemiş kontrol örnekleri, kalan hücre-plazmid karışımından alınır ve önceden ısıtılmış kültür içeren kültür kaplarına eklenir. Elektropore edilen hücreler için kullanılanla aynı bileşime sahip besiyeri kullanılır. Son olarak, kaplar dairesel hareketlerle çalkalanır.

Ardından, transfeksiyon verimliliğini analiz etmeden ve deneyiniz için hangi elektroporasyon koşullarının en iyisi olduğunu belirlemeden önce, hücreleri dağıtmak için plakaya hafifçe vurun ve plakayı 24 saat boyunca 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren inkübatöre yerleştirin. Optimal elektroporasyon koşulları belirlendikten sonra, gelecek deneyler için iki elektroporasyon yöntemi seçeneği mevcuttur. Araştırmacı, hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda işlemeye devam edebilir veya hücreleri her seferinde bir örnek olacak şekilde küvetlerde işleyebilir.

Küvetler her seferinde yalnızca bir örnek alabilir ve 96 kuyucuklu plakaların bir kuyucuğu için gereken hacmin dört katı hacim gerektirir; ancak sadece az sayıda örneğe ihtiyaç duyulduğunda, tekil küvetler daha düşük maliyetlidir ve kullanımı kolaydır. Gene Pulse veya MX hücre sistemi, plakalar ve küvetlerde aynı elektroporasyon ayarlarının kullanılabileceği şekilde tasarlanmıştır. Plaka haznesi yerine, küvetler için mxl şok podunu kullanın.

Plaka haznesini cihazın arkasından çıkarın ve şok podunu takın. Şok podu yalnızca kuyucuk setleri A, B, C, D için programlanmış darbeyi ilettiğinden, farklı bir program seçilmesi gerekebilir. Daha önce kaydedilmiş bir programı seçmek için ana sayfa düğmesine basın.

Ardından üç numaralı seçenek olan kullanıcı protokollerini seçin. Halihazırda doğru kullanıcı klasöründeyseniz, kullanıcı protokollerini seçmek için enter tuşuna basın ve aşağı kaydırın. Doğru programı vurgulamak için, o programı seçmek üzere enter tuşuna basın.

Cihaz şu anda hazırdır. Program seçildikten sonra küvetleri hazırlayın. Plazmid ve MEF karışımı, daha önce gösterildiği şekilde hazırlanır.

Her 0,4 santimetrelik kuyuya, 96 kuyucuklu plakalardaki tüm bir kuyu seti için kullanılan hacmin aynısını yükleyin. Bir kuyu seti dört kuyucuktan oluştuğu ve kuyucuk başına 150 mikrolitre tampon çözelti veya hücre karışımı kullanıldığı için, her kuyuya 600 mikrolitre plazmid hücre karışımı ekleyin.

Ardından veti şok poduna yerleştirin, hücrelere elektrik şoku vermek için pulse düğmesine basın. Elektroporasyondan sonra plaka yöntemiyle devam edin; hücreleri karıştırın, ardından alikotları önceden ısıtılmış besiyeri ile doldurulmuş hücre kültürü plakalarına aktarın ve kontrol grubu belirleyin. Elektropore edilmeyen kuyucukları dahil ederek plakayı dairesel hareketlerle sallayın ve hafifçe vurun.

Ardından, hücreleri transfekte edip iyileşmelerine izin verdikten sonra transfeksiyon verimliliğini analiz etmeden önce, 37 °C'de ve %5 karbon dioksit ortamında 24 saat boyunca iyileşmeye bırakın. Transfeksiyon verimliliğini, epi floresan mikroskopi kullanarak kalitatif olarak ve akış sitometrisi kullanarak kantitatif olarak analiz edin; başarıyla elektropore edilmiş ve şu an GFP genini eksprese eden hücreler, epi floresan mikroskopi altında yeşil görünür, burada tipik bir başarılı sonuç gösterilmektedir. Hücrelerin faz kontrast altında incelenmesi, hem transfekte edilmiş hem de transfekte edilmemiş hücrelerin görüntülenmesini sağlar.

Burada, 200 voltluk en düşük voltajlı elektroporasyon pulsuna maruz bırakılan hücreler gösterilmiştir. Yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle hücreler büyük oranda konfluenttir. Aynı görüş alanı epi-floresan altında incelendiğinde, bir dizi hücrenin GFP markörünü eksprese ettiği görülmektedir; ancak bunlar, 250 voltluk önceki görüntüde görülen hücrelerin yalnızca küçük bir yüzdesini oluşturmaktadır.

Faz kontrastında görülen toplam canlı hücre sayısı, epi floresan altında hafifçe azalmaktadır. Uygulanan en yüksek voltaj olan 375 volt değerinde GFP ekspres eden hücre sayısının arttığı görülmektedir. Daha az canlı hücre görünür durumda olsa da, kalan hücrelerin büyük bir yüzdesi GFP eksprese etmektedir.

Hangi koşulun optimal olduğu deneysel tasarıma bağlıdır. Bazı deneylerde, transfekte edilen hücre sayısının en yüksek olması optimal olabilir. Diğer deneylerde ise en yüksek transfeksiyon yüzdesi en iyisi olabilir.

Her bir koşul altında GFP pozitif olan hücrelerin yüzdesi ve bu yüzdelerin hücre yaşı akışıyla nasıl değiştiği ile ilgileniyoruz. Sitometri, farklı elektroporasyon koşullarının her biri altındaki transfeksiyon sonuçları hakkında kantitatif bilgi sağlayabilir. Burada, pasajdaki GFP pozitif hücrelerin yüzdesi gösterilmiştir.

Beş hücre. 12 elektroporasyon koşulunun her birinde, maksimum transfeksiyon yüzdesi, en yüksek voltajlı eksponansiyel sönümleme altında yaklaşık %80 idi. Darbe koşulu altı ve 70, hücrelerin elektroporasyondan önce dokuz kez pasajlandığı, test edilen en güçlü kare dalga darbe koşulu olan koşul 12 altında gerçekleşmiştir.

Transfeksiyon yüzdesi genel kalıbı neredeyse aynıdır, ancak gösterilen transfeksiyon yüzdelerinde çok hafif bir azalma söz konusudur. Genç hücrelere kıyasla transfeksiyon yüzdesinde belirgin bir azalma gösteren pasaj 13 hücrelerindeki GFP hücre yüzdeleri burada verilmiştir. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri, genç hücrelerle elde edilenlerin yaklaşık yarısı kadardı; bu durum, izolasyondan sonra mümkün olan en kısa sürede sağlıklı hücrelerin kullanılmasının önemini kanıtlamaktadır.

Size, MAPK veya diğer primer hücre hatları için optimal elektroporasyon koşullarını belirlemek amacıyla MXL elektroporasyon sisteminin nasıl kullanılacağını göstermiş oldum. Bu prosedürü gerçekleştirirken, izolasyondan hemen sonra sağlıklı hücreler kullanmayı ve seçilen elektroporasyon koşullarının elektroporasyon tamponu ile uyumlu olduğundan emin olmayı unutmamak önemlidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.