İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Merhaba, ben Mark Parker. Boston, Massachusetts'teki Massachusetts Göz ve Kulak Reviri'ndeki Eaton Peabody Laboratuvarı'na hoş geldiniz. Bugün, kti'nin deniz organının izolasyonu ve birincil kültürü için bir protokol sunacağız.

Bu protokol çalışmalarımızda esastır çünkü işitme için gerekli olan organın in vitro analizine izin verir. Bu yaklaşımın faydasını vurgulamak için, laboratuvarımızdaki organların birçok kullanımından birini, eksojen genlerin kültürlenmiş eksplantlara elektroporasyonunu da göstereceğiz. Hadi işe koyulalım.

Bu prosedürün ana hatları aşağıdaki gibidir, yenidoğan fareleri dekapite edilecek ve künt diseksiyon kullanılarak temporal kemikleri çıkarılacaktır. Daha sonra, koklea künt diseksiyon kullanılarak temporal kemikten izole edilecektir. Kokleanın kemikli labirenti daha sonra forseps kullanılarak açılacak ve spiral ligament kokleanın iç modisinden çıkarılacaktır.

Son olarak, spiral ligament forseps kullanılarak corde organından ayrılacak, kti organının uzunluğu boyunca uzanan saç hücrelerinin yarı saydam gülleri görülebilir. Spiral ligamanın çıkarılması sırasında yırtılmış olan RISE zarının bir kısmı, modüler tarafın uzunluğu boyunca uzanırken görülebilir. Bu prosedürün faydasına bir örnek olarak, organ kord eksplantları 24 saat boyunca kültürlenecek ve daha sonra eksojen bir floresan raportör geni ile elektropore edilecektir.

Bu prosedürün ilk adımları, kültür plakalarının hazırlanmasını içerir. % 70 etanol içinde saklanmış sterilize edilmiş bir cam kapak fişini, önceden sterilize edilmiş dört halkalı hücre kültürü kabının iki kuyusuna yerleştirin. Dört kuyudan sadece ikisinin kullanılması, kültürlerin inkübatör kutusundan çıkma süresini sınırlayacaktır.

Kapak, bire bir poli, l, ornitin ve lamininden oluşan çözelti ile kayar. % 20 fetal sığır serumu ile desteklenmiş, transferini kolaylaştırmak için kültür kabını 10 santimetrelik daha büyük bir kabın içine yerleştirin ve ardından gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Son olarak, gece boyunca 150 santigrat derece inkübatörde kesit aletlerini ısıyla sterilize edin.

Diseksiyon başlamadan önce UV ışığını 20 dakika açarak pozitif akışlı diseksiyon başlığını sterilize edin. Tüm yüzeylere %70 etanol püskürterek diseksiyon başlığı içindeki çalışma alanını sterilize edin. Kafası kesilmiş bir fare yavrusunun başını %70 etanol içeren bir Petri kabına yerleştirin ve ardından bir neşter bıçağı kullanarak epidermisi çıkarın.

Bir neşter bıçağı kullanarak kafatasını sagital sütür boyunca açın ve ardından beyni ikiye bölün. Daha fazla diseksiyon için coddle ön beynini tutun. Künt diseksiyon kullanarak ön beyni, beyinciği ve beyin sapını çıkarın.

Kafatasının inferior lateral tarafındaki parametal şekilli temporal kemiğin konumuna dikkat edin. TAL kemiklerini steril hanks top tuzu çözeltisi içeren üç milimetrelik bir tabağa aktarın. Kalan diseksiyon diseksiyon mikroskobu altında yapılmalıdır.

Temporal kemikten çevredeki dokuları çıkarın. Deniz kabuğu şeklindeki kokleayı bulun ve forseps kullanarak vestibüler sistemden çıkarın. Gelişimin bu aşamasında, kemikli labirent tamamen kalsifiye olmaz ve kolayca disseke edilir.

Kokleanın kemikli labirentini, bazal uçtan başlayarak ve apikal olarak hareket ederek dikkatli bir şekilde ayırarak çıkarın. Forseps kullanarak, spiral ligamenti ve bağlı duyusal epiteli, forseps kullanarak tabanın kanca bölgesine sabitleyerek ve çözerek modisten dikkatlice çıkarın. Tabandan başlayarak hareket ederken, 55 numaralı ince forseps kullanarak spiral ligamenti duyusal epitelden çıkarın.

Bazı deneylerimizde, spiral limmusun duyusal epitelden çıkarılması istenmektedir. Bu mikro ol izolat prosedüründe, kordi organı, forseps olarak iki adet bir buçuk cc insülin şırıngası kullanılarak spiral limbustan izole edilir. İlk olarak, insülin şırıngaları kullanılarak organ kordonunun kanca bölgesi çıkarılır.

Daha sonra, spiral limpus, tepeden başlayarak ve temel olarak bağlı spiral limbus ile Corte'nin tüm organı boyunca ilerleyen iç saç hücreleri sırasından ayrılır. Mikro izole duyusal epitel veya mikro izole spiral limbus aşağıdaki gibi kültürlenebilir, kaplama solüsyonunu kültür kuyucuklarından çıkarın ve bunu% 10 serum transferi içeren 130 mikrolitre kültür ortamı ile değiştirin, corde'un disseke organı kültürdeki kaplanmış cam kapak kaymasına yerleştirilir. Aşağıdaki tekniklerin, korti organının kültür ortamında yüzmemesini, ancak kapak fişine bağlı kalmasını sağlamaya yardımcı olduğunu bulduk.

İlk kat, cam kapak tarif edildiği gibi kayar. İkinci olarak, explan'ı kaplanmış tabağa yapıştırmak için ortamı çıkarın. Bu, kültür kabı ile X exrelease arasındaki teması sağlayacaktır.

Üçüncüsü, saç hücrelerinin kirpikleri yukarı bakacak şekilde explan'ı yönlendirin. Bu oryantasyon, explan'ın kültür yemeğine yapışmasını kolaylaştıracaktır. Son olarak, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak 130 mikrolitre serum kültürü ortamı ekleyin, organ uyumunun yüzeyine dikkatlice iki damla damlatın ve ardından kalan hacmi yavaşça kuyu tarafına ekleyin, explan'ı dikkatlice bir inkübatöre taşıyın ve ardından %5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derece inkübe edin.

Bu kültürler yedi ila 10 gün boyunca korunabilir. Bazı örnekler, R-T-P-C-R veya NC iki hibridizasyon kullanılarak gen ekspresyonunun analizini, spiral ganglion hücreleri veya eksojen kök hücrelerle kortiko kültürü organını veya saç hücresi ölümünün in vitro analizini içerir. Bu prosedürün faydasını göstermek için, size laboratuvarımızda eksplan kültürlerindeki eksojen genleri eksprese etmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik göstereceğiz.

Bu gösteri için, izole edilmiş korti organı, DS kırmızı muhabir genini yapısal olarak ifade eden bir ekspresyon vektörü ile elektro geçit töreni olacaktır. Elektroporasyondan sonra, kültürler, transfeksiyon prosedürünü geliştirmek için 24 saat boyunca birkaç gen altı transfeksiyon reaktifi ile inkübe edilecektir. Bu sistemi kullanarak, transfekte edilen hücreler 24 saat içinde sitoplazmik bir kırmızı floresan sergileyecektir.

İlk olarak, üç mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polistiren test tüpünde hedef DNA'ya üç ila iki oranında FU geni altı transfeksiyon reaktifi hazırlayın. Laminer bir akış başlığında, kültür ortamını bahçecilik organından çıkarın. Bir dakika boyunca 130 mikrolitre su ekleyin ve ardından 200 mikrolitre kapasiteli bir pipet kullanarak çıkarın.

Daha sonra, mililitre su başına iki miligram plazmit DNA'dan oluşan bir stok çözeltisinde saklanan 30 mikrolitre DS kırmızı raportör plazmidi ekleyin. Elektroporasyon için, elektrik darbesini oluşturmak için bir BioRad geni Pulser Excel kullanıyoruz. Elektrotlar, makine atölyemiz tarafından amaçlarımızı karşılayacak şekilde özelleştirilmiştir, elektrotlar 90 derecelik bir açıyla bükülmüş ve kürek şeklinde kıvrılmış çıplak telden oluşmaktadır.

Bir mikro manipülatör kullanarak elektronun elektrotlarını ilerletin, böylece anot ve katot kültürün her iki tarafında olur. Raportör geni organ akordiyon explan kültürüne elektro saflaştırmak için 27 volt ve 30 milisaniye süreden oluşan 10 darbe treni oluşturun. Ardından beş dakika bekleyin.

Daha sonra, açıklamaya 130 mikrolitre FU geni altı DNA çözeltisi ekleyin ve daha sonra gece boyunca% 5 karbondioksit varlığında 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün kültüre iki mililitre serum ekleyin, her plakaya ortam. Eksplan kültürleri 24 saat sonra altı veya daha fazla gün boyunca korunabilir.

Kesilmiş hücreler, bir epi floresan mikroskobunda bir SI üç filtre kullanılarak görüntülenebilir. Az önce size Corte organının izolasyonu ve birincil kültürü için bir yöntem gösterdik. Bu yöntem, embriyonik 16. günden doğum sonrası güne kadar genç farelerde çalışır, bu noktada koklea, diseksiyonu hantal hale getirmek için yeterince kalsifiye olur.

Ek olarak, ekzojen genlerin kültürlenmiş corde organına ekspresyonu için bir yöntem gösterdik. Bu, kültürlenmiş açıklama üzerinde gerçekleştirilebilecek bir tür deney örneğidir. Hiç şüphe yok ki bu tekniğin çok sayıda kullanımı vardır.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.