Name: İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Öğrenin, yeni doğan farelerden Corti organı izolasyonu ve kültürü ile elektroporasyon tekniğini. Bu yöntem, işitme hücreleri biyolojisi ve gen fonksiyonu çalışmaları için temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Demêmes Danielle ve Douglas Cotanche teşekkür etmek ve bize Corti organı izolasyonu için öğretim yöntemleri çabaları için. Sherry Lin video animasyon onu katkıda sanat için; ve Matthew Chana Jason Meeker ve Kendra Marshall (Ayrıca, Elektroporatör elektrotlar mühendislik Stefanov-Wagner İsmail&#39;in teşekkür etmek istiyorum <a href="http://www.goodfightproductions.com">www.goodfightproductions.com</a> ) video üretimi için. Bu çalışma NIDCD hibeler (İşitme Araştırma P30DC05209-MEEI Çekirdek Desteği; RO1DC007174-Kenar R03DC010065-Parker) tarafından finanse edildi.

1. Gün. Sterilizasyon ve cam lamelleri kaplama. <ol><li> Cam mikroskop lamelleri otoklavda sterilize kurulayın. </li><li> Sterilize lamelleri önceden sterilize dört kuyu hücre kültürü çanak iki kuyu içine yerleştirin. </li><li> Coat 01:01 poli-L-ornitin ve laminin lamelleri 4 gecede% 20 fetal sığır serum (FBS) ° C ile desteklenmiş <ol class="lalpha"><li> 400 mcL poli-L-ornitin (4 saklanan% 0.01 çözüm ° C) </li><li> 400 mcL laminin (50 mikrogram / mL stok çözelti, -20 ° C'de alikotları saklanan) </li><li> 200 mcL FBS (-20 ° C'de alikotları saklanır) </li></ol></li><li> Isı-150 ° C inkübatör diseksiyon araçları gecede sterilize edin. </li><li> % 10 serum ve 10 mg / ml ampisilin içeren kültür ortamı olun. <ol class="lalpha"><li> 90 ml Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta </li><li> 5 ml FBS (-20 ° C'de alikotları saklanan) </li><li> 5 ml at serumu (-20 ° C'de alikotları saklanan) </li><li> 10 mcL ampisilin (4 saklanan 10 mg / ml stok solüsyonu ° C) </li></ol></li></ol> 2. Gün. Corti organı izolasyonu. <ol><li> Pozitif akış diseksiyonu kaput sterilize edin. <ol class="lalpha"><li> 20 dakika UV ışığı açmak </li><li> % 70 etanol ile tüm yüzeylerde püskürtme ve kullanmadan önce 5 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Işletim makas kullanarak foramen magnum dibinde yavru başını kesmek fare (P4). </li><li> Kısaca% 70 etanol içeren 10 cm çanak baş durulayın. </li><li> Epidermis bir neşter bıçak kullanarak çıkarın. </li><li> Bir neşter bıçak kullanarak sagital sütür boyunca kafatası açın ve sonra önbeyin iki eşit parçaya böler. Daha fazla diseksiyon için kaudal önbeyin saklayın. </li><li> Künt diseksiyon ile ön beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın. </li><li> Temporal kemikleri çıkarın (şekil 2A),% 70 etanol kısaca daldırma ve steril HBSS içeren 3 mm çanak aktarabilirsiniz. </li><li> Forseps kullanarak, temporal kemik petröz kısmı bül ve çevresindeki doku çıkarın. </li><li> Kabuklu şeklinde koklea (şekil 2B) bulun ve forseps kullanarak vestibüler sistem ayrı. </li><li> Gelişme bu aşamada, kemik labirent tamamen kalsifiye ve forseps kullanarak kolayca diseke edilir. Koklea bazal sonunda başlayan ve forseps kullanılarak apikal hareket dikkatli ayrılması ile kemik labirent çıkarın. </li><li> Spiral ligament ve Corti ekli organ modiolus (Şekil 2C) spiral boyunca kıvrılmış. Corti organı forseps kullanarak taban kanca bölgede spiral ligament ve apikal hareket olarak gevşemek dikkatlice çıkarın. </li><li> # 55 ince forseps (şekil 2B) kullanan Corti organı üssünde başlayarak, spiral ligament kaldırmak. Mikro-izolasyon, Corti duyu epitel (isteğe bağlı) organı . </li><li> Corti kanca bölgenin iki kullanarak temel organı çıkarın ½ cc İnsülin Şırınga ile kalıcı bağlı U-100 28G ½ forseps gibi iğneler. </li><li> Apeks başlayarak, iç saç hücrelerinin satır spiral limbus kaldırmak ve dorsalde devam (Şekil 2E-F). Corti eksplant organı Kaplama </li><li> Kültür kuyulardan poly-L-ornithine/laminin/FBS çözüm çıkarın ve 130 ul kültür ortamı ekleyin. </li><li> Corti organı disseke ve şark kültüründe kaplı cam lamel saç hücrelerinin silya işaret ediyor ki eksplant aktarın. </li><li> 200 mcL pipet kullanarak kültür orta çıkarın. Baziler membran kaplı cam lamel ile sürekli temas edinceye emin olun. </li><li> Corti organı, 200 ml'lik pipet kullanarak dikkatlice kültür ortamı 130 mcL ekleyin. Corti organı yüzeye iki damla uygulayın ve sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim kazandırmak. Corti organı lamel yapıştırılmış kalır kültür ortamı yüzer, ama yaptığı emin olun. </li><li> 37 ° C'de% 5 CO 2 'nin varlığı bir gece inkübe edin. </li></ol> 3. Gün. Corti kültürlü organ haline muhabiri gen Elektroporasyon. <ol><li> Corti organı kültür kültür ortamı çıkarın. </li><li> 1 dakika için 130 mcL H 2 O ekleyin ve sonra 200 mcL pipet kullanarak kaldırın. </li><li> Plazmid DsRed muhabiri (-20 ° C'de saklanan 2 mg / ml H 2 O) 30 mcL ekleyin. </li><li> Böylece bir micromanipulator kullanarak Elektroporatör elektrotlar Advance anot birnd katot kültürünün her iki tarafta. </li><li> Corti organı eksplant kültür içine muhabir gen electroporate bir darbe (27V, 30 ms süresi, 10 darbe trenleri) oluşturun. <ol class="lalpha"><li> İsteğe bağlı: modiolar ve eksplant spiral ligament her iki transgen elektroporasyon sağlamak için nabız kutuplarını ters. </li></ol></li><li> 5 dakika bekleyin. </li><li> DNA solüsyonu (3 2 parça DNA parçaları Fugene): Fugene 6 130 mcL ekleyin. Bu çözüm, bir laminer akış kaputu 3 ml'lik bir yuvarlak alt polistiren test tüpü kullanarak elektroporasyon prosedürü start (20 adım) önce hazırlanmış olmalıdır. Bu çözüm yapmak için: <ol class="lalpha"><li> Opti-MEM (4 ° C'de saklanan) 2.4 mcL test tüpüne ekleyin. </li><li> Fugene 6 reaktifin test tüpüne 0.6 mcL (4 ° C'de saklanan) ekleyin. Opti-MEM Fugene doğrudan ve test tüpü iki ile doğrudan temas önlemek için emin olun. </li><li> 1 saniye vorteksleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 2.0 mcL DsRed muhabiri plazmid çift iplikli DNA (100 mg DNA / ml H 2 O alikotları -20 ° C'de saklanan) ekleyin. </li><li> 1 saniye vorteksleyin. </li><li> Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. </li><li> Kültür ortamı 200 mcL ekleyin. </li><li> 1 saniye vorteksleyin. </li></ol></li><li> 37 ° C'de% 5 CO 2 'gece inkübe edin. </li><li> 2 ml kültür ortamı kültürü de ekleyin ve 37 ° C de 10 gün öncesine kadar inkübe edin. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Biz perinatal bir fare Corti organı izolasyonu için bir yöntem mevcut. Bu prosedür, kemik labirent diseksiyonu hantal işlemek için yeterli kalsifiye olur ve bu noktada, postnatal günde yaklaşık 16 kadar embriyonik gün gibi genç fareler 6 için kullanılabilir. Corti organı disseke sonra, ya bütünüyle (Şekil 3) veya mikro-izole duyu epitel (Şekil 4) kaplama ve kültürlü olabilir. Biz daha Corti kültürlü organ ekzojen genlerin ifade etmek için bir teknik sunduk. Organotipik kültür Corti gen ekspresyonu RT-PCR veya in situ hibridizasyon, spiral ganglion hücrelerinin mikro-izole kullanarak veya eksojen kök hücreler ile Corti ko-kültür organ organ analizi gibi pek çok çalışma, diğer türleri için yararlıdır 3 veya saç hücre ölümü ve rejenerasyon in vitro analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"></a> Şekil 1. Corti P4 fare organ kesiti. (A) P4 fare elde cryosectioned koklea bazal kıvrımı bir kesit, bu protokolde tanımlanan fare kokleanın genel yapısını göstermektedir . Scala media yanal vascularis spiral ligament ve stria ile sınırlanmıştır Reissner s membran süperiora, spiral limbus mediale ve inferiora baziler membran. Kutusu B. genişletilmiş bölge (B) Corti organı baziler membran üst tarafında bulunan ve iç saç hücreleri, üç sıra dış saç hücrelerinin ve kendi destekleyen hücreleri tek bir satır içerir. Kesikli çizgi 1 Corti, bu organ diseksiyonu sırasında kaldırılır baziler membran boyunca yerini gösterir. Kesikli çizgi 2 mikro-izolasyon prosedürü sırasında kaldırılır baziler membran boyunca yerini gösterir. Yeşil immünohistokimyasal etiketleme, spiral limbus interdental hücreler, koklear saçlı hücreler, spiral ganglion nöronlar, spiral ligament ve 7 vascularis stria hücrelerinin yanı sıra etiketler Calbindin gösterir. Çekirdeğinin DAPI etiketleme mavi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"></a> Şekil 2. Corti diseksiyonu vurgulamak organ beraberindeki video Corti diseksiyonu Organ Görüntüleri A) izole temporal kemik (kırmızı) içinde bulunan koklea ve vestibüler sistem, B) koklea kemik labirent, C), spiral ligament ve ekli spiral ligament, kemik labirent, D çıkarılmasından sonra Corti organı) kaldırılması ve stria vascularis (kırmızı), E Corti organı) spiral limbus (kırmızı) duyu epitel mikro-izolasyon, ve F) izole spiral limbus (sol) ve duyu epitel (sağda). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"></a> Şekil 3. Corti eksplant Kültüre organın organ gösteren DIC görüntüCorti açıklandığı gibi beş gün için, izole, kaplama, ve kültürlü bir P4 Atoh1 nGFP fare. Bu fare yanlısı saç hücresi gen Atonal homolog 1 (Atoh1 aka Math1) ifade hücrelerin çekirdeğini 8 lokalize bir yeşil flüoresan protein sergi, böylece genetik olarak tasarlandı. Corti organları bu farelerden alınan tüm saç hücresi çekirdekleri bir nükleer GFP etiketi gösterirler ve bu nedenle duyu epitel epifluorescent bir mikroskop kullanılarak daha kolay görsellik için izin. Nispeten büyük sarmal limbus duyu epitel lateralinde görülebilir. Corti organı kaynaklı mezenkimal hücreler eksplant uzak geçirdim. Mavi nükleer etiket DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig4.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig4tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"></a> Şekil 4. Mikro-izole duyu epitel açıklanan ve bir gecede kültüre, Corti P4 fare organı izole edilmiştir duyu epitel elde Epifluorescent görüntü . Mikro-izole sonra% 4 paraformaldehid sabit ve koklear saçlı hücreler etiketler Miyozin 7a immunolabeling için işlendi. Şekil 3, nispeten daha büyük bir sarmal limbus olmadığına dikkat edin. Mavi nükleer etiket DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1685/1685fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1685/1685fig5tmb.jpg" alt="Şekil 5" border="0" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"></a> Şekil 5. Corti kültürlü organ haline DsRed muhabiri gen Elektroporasyon P4 Atoh1 nGFP fare yavrular Corti Tüm organlar izole edilmiştir, kaplama, ve sonra, epifluorescent bir mikroskop altında açıklanan ve daha sonra bakıldığında DsRed muhabiri gen ile electroporated. Transgenik DsRed muhabiri protein ifade Corti eksplant organ hücreleri duyu epitel sergi yeşil bir nükleer floresan kırmızı floresan ve endojen hücreler sergilerler. Transgenik hücrelerin spiral limbus ve duyusal epitel boyunca görülebilir.

<ol><li>Sobkowicz, H. M., Bereman, B., Rose, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+Development+of+the+Organ+of+Corti+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Organotypic Development of the Organ of Corti in Culture.</a> Journal of Neurocytology. 119 (4), 543-543 (1975).</li>
<li>Zheng, J. L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Math1+induces+robust+production+of+extra+hair+cells+in+postnatal+rat+inner+ears%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears.</a> Nature Neuroscience. 3 (6), 580-580 (2000).</li>
<li>Martinez-Monedero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THE+POTENTIAL+ROLE+OF+ENDOGENOUS+STEM+CELLS+IN+REGENERATION+OF+THE+INNER+EAR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">THE POTENTIAL ROLE OF ENDOGENOUS STEM CELLS IN REGENERATION OF THE INNER EAR.</a> J Neurobiol. 66 (4), 319-319 (2006).</li>
<li>Saffer, L. D., Gu, R., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RT-PCR+analysis+of+mRNA+for+growth+factor+receptors+in+damaged+and+control+sensory+epithelia+of+rat+utricles%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">An RT-PCR analysis of mRNA for growth factor receptors in damaged and control sensory epithelia of rat utricles.</a> Hearing Research. 94 (1,2), 14-14 (1996).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+growth+and+differentiation+of+hair+cell+progenitors+from+the+newborn+rat+cochlear+greater+epithelial+ridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, growth and differentiation of hair cell progenitors from the newborn rat cochlear greater epithelial ridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 164 (2), 271-271 (2007).</li>
<li>Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Differentiation+and+DNA+Binding+%28Ids%29+Regulate+Math1+and+Hair+Cell+Formation+during+the+Development+of+the+Organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Differentiation and DNA Binding (Ids) Regulate Math1 and Hair Cell Formation during the Development of the Organ of Corti.</a> J. Neurosci. 26 (2), 550-550 (2006).</li>
<li>Daniela, B., Josef, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calbindin+and+S100+protein+expression+in+the+developing+inner+ear+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Calbindin and S100 protein expression in the developing inner ear in mice.</a> The Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 469-469 (2009).</li>
<li>Helms, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127 (6), 1185-1185 (2000).</li>
<li>Zheng, J. L., Wei-Qiang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Damage+to+Auditory+Neurons+and+Hair+Cells+by+Ototoxins+and+Neuroprotection+by+Specific+Neurotrophins+in+Rat+Cochlear+Organotypic+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential Damage to Auditory Neurons and Hair Cells by Ototoxins and Neuroprotection by Specific Neurotrophins in Rat Cochlear Organotypic Cultures.</a> European Journal of Neuroscience. 8 (9), 1897-1897 (1996).</li>
</ol>

Bu prosedürün başarısı için kritik olan pek çok ayrıntı vardır. Temporal kemik izolasyon Corti inkübasyon, organları canlı organ kültürlerinde lamel ve sonuç eklemek edeceği büyük şansı organ için kısa zaman. Bu nedenle, diseksiyon ve organları inkübatör yerleştirerek arasındaki süreyi sınırlamak için önemlidir. Antibiyotik seçimi, birçok aminoglikozid antibiyotikler ototoksik ve saç hücre ölümüne neden olacağından da çok önemlidir. Antibiyotik kullanımı tamamen vazgeçmek için tercih edilse de, bu kirlenme olasılığını açık bırakıyor. Bu nedenle, potansiyel kirlenme sorunların üstesinden gelmek için genel bir kural olarak 10 mikrogram / ml ampisilin kullanmanızı öneririz. Bu en sıkıntılı yönü ve diğer prosedürler Corti organı temel kültür, inkübasyon sırasında plakaları float organlarının eğilimidir. Kayan organ kültürleri, 5-7 gün boyunca canlı kalır rağmen, kültür yüzen organların sakıncaları vardır. Örneğin, mikroskopi sorunlu hale 4-5 gün sonra genellikle kendileri üzerine kat yüzen organ kültürleri. Daha sonra, lamel yapıştırılmış olan organlara kıyasla organın yapısal bütünlüğünü tehlikeye düşer. Corti organı kültür ortamı float olmadığından emin olmak için aşağıdaki teknikleri yardımcı olduğunu bulduk, ancak lamel yapıştırılmış kalır. Birincisi, 01:01 polyornithine / laminin kat cam lamelleri olarak açıklanan% 20 FBS ile desteklenmiştir. Bu protokol adı verilen gecede inkübasyon plaka kaplı olması gerektiği minimum süredir. Laboratuvarımızda, sık sık kat biz bir hafta boyunca ihtiyaç ve 4 tutmak plakaların ° C güne kadar biz onları bir gecede inkübasyon için inkübatör taşıdığınızda kullanımdan önce. İkincisi, organlar saç hücrelerinin silya bakacak şekilde yönlendirmek, kaplamalı lamelleri eksplant taşınır sonra. Bu yönelim, kültür çanak baziler membran bağlılık kolaylaştıracaktır. Üçüncü olarak, eksplant kaplı çanak yapıştırmayın kuyu içinde medya kaldırmak. Bu kültür çanağı ve baziler membran arasında temas sağlamak ve cama yapışır eksplantlar yeteneğini artıracaktır. Bu aynı zamanda saç hücrelerinin satır yapısal bütünlüğünü korumak yardımcı olacaktır. Son olarak, dikkatli bir şekilde yüzeye 200 mcL kapasitesi pipet kullanarak Corti organı kültür ortamı 2 damla damla ve daha sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim (toplam 130 mcL) damlayan tarafından iyi doldurun. Corti organı kaplı lamel eki sağlamak için hızlı bir şekilde çalışmak için çok önemlidir. Eksplantlar kuluçka diseksiyon başlangıcından itibaren, genellikle uygulanan bir operatör için bu organ Corti izolasyon prosedürü tamamlamak için 10 dakika sürer. Bu protokol, biz de spiral Corti organı limbustan duyu epiteli mikro-izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde, spiral limbus 28G kullanarak duyu epitel gaita ½ diseksiyon araçları olarak insülin iğneleri. Mikro-izole saç hücreleri ve bunlara karşılık gelen destekleyen hücrelerin (Şekil 3) satırları oluşur. Bu protokol açıklandığı gibi izole duyu epitel sonra yetiştirilebilir. Bu mikro-izolasyon prosedürü duyu epitel doku 4 çevreleyen enzimatik ayırma karşılaştırılmalıdır. Gibi tavuk, bodrum mezenkimal hücreler 4 duyu epitel izolasyon izole vestibüler organları thermolysin sindirim gibi memelilerin yanı sıra, non-memeli. Rat koklea, büyük epitel sırt ayrılması, daha az epitel sırt ve eşlik eden duyusal epitelde bazal membran 5 thermolysin sindirim sonuçları. Ancak, koklear duyu epitel beraberindeki mezenkimal hücreler olmadan kaplı plakalar ekleyebilirsiniz belirsizdir. Mekanik mikro-izolasyon yöntemi ve enzimatik sindirim yöntemi spiral limbustan duyu epitel ayrılması sonucu, thermolysin sindirim üzerinde mikro-izole diseksiyon avantajları hem de nispeten daha kısa bir protokol, ucuz reaktifler ve potansiyel olarak daha az stres sindirim enzimatik etkileri nedeniyle eksplant. Ayrıca, bazal membran kültür plaka duyu epitel eki artırabilir, bu yaklaşım sağlam bırakılır. Bu yöntemin dezavantajları bu hassas diseksiyon ve duyu epiteli mikro diseksiyon kaynaklanan potansiyel mekanik hasar becerilerini geliştirmek için ihtiyaç içerir. Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, biz de organ kullanımının bir örnek sunmakCorti kültürleri; eksplant kültür ekzojen genlerin elektroporasyon. Corti elektroporasyon organ önceki yöntem, yukarıda açıklanan elektroporasyon prosedürü dayanır. Özellikle, Zheng ve Gao (2000) eksplantlar elektroporasyon için agaroz bir kalıp oluk tarafından yerinde tutulur ve daha sonra kolajen serum orta 2 kaplamalı 8-iyi LABTEK slayt kaplama Corti izole sıçan organlarının elektroporasyon açıklar. Kendi yaklaşımının bir avantajı organları eksplantlar üst yüzeyleri teorik eksplant üzerinde electroporated hücreleri düzgün bir dağıtım sonuçlanması gerekiyor katot, yüz böylece odaklı. Corti organı böylece elektroporasyon sonra eksplant manipülasyon azaltarak işlem boyunca lamel yapıştırılmış kaldı, çünkü bizim elimizde ise, tarif yöntemi bu yordamı geliştirilmiş. Ayrıca, Corti organların daha yüksek bir yüzdesi sunulan bu yöntemi kullanarak lamelleri bağlı kaldı. Bizim yöntemi Jones ve ark (2006) Fugene 6 reaktif elektroporasyon sonra gen ekspresyonu verimliliğini artırmak için ek kullanır alınır. Jones ve arkadaşları (2006) protokolü, organları, electroporated Fugene 6 transfeksiyon reaktif mcL 100 ve 6 kaplama ile 5 dakika inkübe. Bizim yöntem Fugene 6 reaktif bir 3:2 oranı minimum organ toksisitesi ile optimal transgenik ifade sağlamak için deneysel olarak bulundu. Plazmid DNA kullanımı farklıdır. Kültürlere toksisite neden olabilir, sulandırılmamış Fugene 6 reaktif kullanmayın. Bizim protokol elektrod yapılandırma yanı sıra spiral limbus veya katot pozisyonuna bağlı olarak duyu epitel birincil gen ekspresyonu Jones ve arkadaşları (2006), sonuçlar. Katot uzak kültürünün yan DsRed pozitif hücreler olmasına rağmen, katot yakın transgenik hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu vardır. Transgen eksplant Corti organı her iki tarafında tam bir ifade sağlamak için, mevcut yol açar sadece tersini ikinci bir darbe tren ters olabilir. Corti organı (Şekil 5) boyunca transgen sağlam ifade sunulan protokol sonuçları.

<table><tbody><tr><td>Cam mikroskop lamel</td><td>DYNALAB Corporation</td><td>2010</td><td>10mm çap, daire #1, 1mm kalınlık, 1 ons</td></tr><tr><td>4 halkalı hücre kültürü kabı</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td>4 iç halkalı sterilize 35 X 10 mm hücre kültürü kabı</td></tr><tr><td>Poly-L-ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>%0,01 Çözelti</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354232</td><td>fare kaynaklı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>26140-095</td><td>Kalifiye</td></tr><tr><td>Ameliyat makası</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td>Düz, keskin-küt uzunluk 5&quot;</td></tr><tr><td>#11 Bistüri Bıçağı</td><td>BD Biosciences</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>#4 Dumoxel pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>#55 Dumostar ince pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modifiye Eagle Besiyeri </td><td>Invitrogen</td><td>10564-011</td><td>Yüksek Glikoz</td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>2605088</td><td>Isıyla İnaktive Edilmiş</td></tr><tr><td>Ampisilin Sodyum Tuzu </td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td>Işınlanmış</td></tr><tr><td>&amp;frac12; cc Düşük Doz İnsülin Enjektörü </td><td>BD Biosciences</td><td>329465</td><td>U-100 28G&amp;#189;</td></tr><tr><td>Fugene 6 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Roche Group</td><td>11-815-091-001</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren test tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-5A</td><td></td></tr><tr><td>Laminar akışlı kabin</td><td>The Baker Company (Stanford, ME)</td><td>Model SG603a</td><td>SterileGARD III&lt;br/&gt;Gelişmiş Sınıf II&lt;br/&gt;Biyolojik Güvenlik Kabini</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış-Serum Besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Raporlayıcı plazmid</td><td>Clontech Laboratories</td><td>632539</td><td>pCMV DsRed-Express 2</td></tr><tr><td>Elektroporatör</td><td>Bio-Rad</td><td>165&amp;#8211;2662</td><td>BioRad Gene Pulser Xcell</td></tr></tbody></table>

İlköğretim kültür ve corti murin organ plazmid elektroporasyon.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Tüm memeliler, seçmelere için duyu epiteli, iç kulak (Şekil 1) kabuklu şeklinde koklea içinde bulunduğu spiral şeklindeki organ Corti boyunca yer almaktadır. Işitme sistemi mechanosensory hücreleri gelişmekte olan koklea, saç hücreleri tek bir satır ve iç saç hücreleri üç (temel ve orta-dönüşleri) dört (apikal sırayla) dış saç hücrelerinin satır hizalanır Corti organı süresini kapsar. Saç hücreleri, beyin yorumlayabilir sinirsel uyarılara çeviren baziler membran ses kaynaklı mekanik titreşimler transduce. Sensorinöral işitme kaybı vakalarının çoğu koklear saçlı hücreler ölüm veya işlev bozukluğundan kaynaklanır. Işitsel araştırma, giderek daha temel bir araç izolasyon ve organ eksplant 1,2,9 in vitro kültürü . Izole sonra, eksplantlar bilgilere ilişkin normatif, anormal, ya da terapötik fizyolojisi sağlamak için çeşitli şekillerde kullanılabilir. Gen ifadesi, stereocilia motilite, hücre ve moleküler biyoloji, yanı sıra saç hücre rejenerasyonu için biyolojik yaklaşımlar Corti eksplantlar organ deneysel uygulamaların örnekleridir. Bu protokol, yenidoğan farelerin Corti organı izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. İlişikteki video fare yavrular temporal kemik izolasyonu için adım adım talimatlar ve koklea, spiral ligament ve Corti organı sonraki izolasyon içerir. Bir kez izole edilmiş, duyusal epitel kaplama ve bütünüyle in vitro olarak kültüre, ya da bir başka disseke spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar yoksun olduğu mikro-izole eder . edilebilir Bu yöntemi kullanarak, birincil eksplantlar 7-10 gün süreyle muhafaza edilebilir. Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, Corti eksplantlar organı dışsal DsRed muhabiri gen electroporated olacaktır. Izolasyon, mikrodiseksiyon ve Corti organı primer kültür, tekrarlanabilir, net, ve adım adım yönergeleri sağlar, çünkü bu yöntem yayınlanan diğer yöntemleri üzerinde bir iyileşme sağlar.

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Tüm memelilerde, işitme için duyusal epitel, ...'nın konç şeklindeki kokleası içerisinde yer alan ve spiral bir yapıya sahip olan Corti organı boyunca konumlanmıştır.

Merhaba, ben Mark Parker. Boston, Massachusetts'teki Massachusetts Eye and Ear Infirmary bünyesindeki Eaton Peabody Laboratuvarı'na hoş geldiniz. Bugün, kti deniz organının izolasyonu ve birincil kültürü için bir protokol sunacağız.Bu protokol, işitme için temel olan organın in vitro analizine olanak tanıdığı için çalışmalarımızda temel bir yere sahiptir. Bu yaklaşımın faydasını vurgulamak için, laboratuvarımızdaki organların birçok kullanım alanından biri olan, kültüre edilmiş eksplantlara ekzojen genlerin elektroporasyonunu da göstereceğiz. Haydi çalışmaya başlayalım.Bu prosedürün ana hatları şöyledir; yenidoğan farelerde dekaptasyon yapılacak ve temporal kemikler künt diseksiyon yöntemiyle çıkarılacaktır. Ardından, koklea temporal kemikten künt diseksiyon kullanılarak izole edilecektir. Daha sonra kokleanın kemikli labirenti penset yardımıyla açılacak ve spiral ligament kokleanın iç modiusundan uzaklaştırılacaktır.Son olarak, spiral ligaman pensle organ of corti'den ayrılacaktır; tüy hücrelerinin yarı saydam rozetleri organ of corti boyunca uzanırken görülebilir. Spiral ligamanın çıkarılması sırasında yırtılmış olan Reissner membranı'nın bir kısmının modüler taraf boyunca uzandığı görülebilir. Bu prosedürün faydasına örnek olarak, organ of corti eksplantları 24 saat boyunca kültüre edilecek ve ardından ekzojen bir floresan raporlayıcı gen ile elektroporasyon işlemine tabi tutulacaktır.Bu prosedürün ilk adımları kültür plaklarının hazırlanmasını içerir. %70 etanol içinde saklanmış steril bir cam lamelle, önceden sterilize edilmiş dört halkalı bir hücre kültürü kabının iki kuyucuğuna yerleştirin. Dört kuyucuktan sadece ikisinin kullanılması, kültürlerin inkubatör taşıyıcısının dışında kaldığı süreyi sınırlayacaktır.Bir bir oranında poli-L-ornitin ve laminin içeren çözeltili lameller, %20 fetal bovine serum ile desteklenerek, transferini kolaylaştırmak amacıyla daha büyük bir 10 santimetrelik petri kabı içerisine yerleştirilmiş kültür kabıyla birlikte 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Son olarak, kesit alma araçları 150 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca ısı ile sterilize edilir.Diseksiyon başlangıcından önce, UV ışığını 20 dakika boyunca açık tutarak pozitif akışlı diseksiyon kabinini sterilize edin. Diseksiyon kabini içindeki çalışma alanını, tüm yüzeylere %70 etanol püskürterek sterilize edin. Dekapite edilmiş bir fare yavrusunun başını %70 etanol içeren bir Petri kabına yerleştirin ve ardından epidermis tabakasını bir bistüri ucu kullanarak kaldırın.Kafatası, sagital sütür boyunca bir skalpel bıçağı kullanılarak açılır ve ardından ön beyin için ikiye bölünür. İleride yapılacak diseksiyonlar için ön beyin saklanır. Ön beyin, serebellum ve beyin sapı künt diseksiyon yöntemiyle çıkarılır.Kranyumun inferior lateral tarafındaki parametal şekilli temporal kemiğin konumunu not edin. TAL kemiklerini, steril hanks balanced salt solution içeren üç milimetrelik bir kaba aktarın. Geri kalan diseksiyon, bir diseksiyon mikroskobu altında gerçekleştirilmelidir.Temporal kemiğin etrafındaki tüm dokuları temizleyin. Salyangoz şeklindeki kokleayı bulun ve bir penset kullanarak vestibüler sistemden ayırın. Gelişimin bu aşamasında kemik labirent henüz tamamen kalsifiye olmamıştır ve kolayca diseke edilebilir.Bazal uçtan başlayıp apikal yöne doğru ilerleyerek dikkatli bir ayırma işlemiyle kohleanın kemik labirentini çıkarın. Pens yardımıyla, bazal bölgedeki kanca kısmından sabitleyerek ve geri sararak, spiral ligamanı ve ona bağlı duyusal epitelyumu modius'tan dikkatlice uzaklaştırın. Bazdan başlayarak, 55 numara ince pens kullanarak spiral ligamanı duyusal epitelyumdan ayırın.Bazı deneylerimizde, spiral limbusun duyusal epitelden uzaklaştırılması istenir. Bu mikro izolasyon prosedüründe, organ of Corti, pens olarak kullanılan iki adet yarım cc'lik insülin şırıngası yardımıyla spiral limbustan izole edilir. İlk olarak, organ of Corti'nin kanca bölgesi insülin şırıngaları kullanılarak uzaklaştırılır.Ardından, apeks kısmından başlanarak bazale doğru ilerleyen iç tüy hücreleri sırasından, spiral limbus ya da spiral limbus ile birlikte organ of Corti'nin tamamı ayrılır. Mikro izole edilmiş duyusal epitel veya mikro izole edilmiş spiral limbus şu şekilde kültüre edilebilir: kaplama solüsyonu kültür kuyucuklarından uzaklaştırılır ve yerine %10 serum transfer içeren 130 microliters kültür medyası eklenir; diseke edilmiş organ of Corti, kültür kuyucuğundaki kaplanmış cam lamı üzerine yerleştirilir. Organ of Corti'nin kültür medyasında yüzmediğinden ve lam üzerine sabit kaldığından emin olmak için aşağıdaki tekniklerin yardımcı olduğu saptanmıştır.İlk olarak, cam lamellerle tanımlandığı şekilde kaplama yapılır. İkinci olarak, explanı kaplanmış kaba sabitlemek için ortam kaldırılır. Bu işlem, kültür kabı ile X explanı arasındaki teması sağlayacaktır.Üçüncü olarak, tüy hücrelerinin silyaları yukarı bakacak şekilde eksplantı yönlendirin. Bu yönlendirme, eksplantın kültür kabına tutunmasını kolaylaştıracaktır. Son olarak, 200 µL'lik bir pipet kullanarak 130 µL serumlu kültür medyumu ekleyin; bunu gerçekleştirmek için önce organ dokusunun yüzeyine dikkatlice iki damla damlatın ve ardından kalan hacmi kuyucuğun kenarına yavaşça ekleyin. Eksplantı dikkatlice bir inkübatöre yerleştirin ve ardından %5 karbondioksit varlığında 37 °C'de inkübe edin.Bu kültürler yedi ila 10 gün boyunca sürdürülebilir. İzole edilen korteks organının çok sayıda uygulama alanı vardır. Bazı örnekler arasında R-T-P-C-R veya NC iki hibridizasyon kullanılarak gen ekspresyon analizi, spiral ganglion hücreleri veya ekzojen kök hücrelerle korteks organ kültürü veya tüy hücresi ölümünün in vitro analizi yer almaktadır. Bu prosedürün faydasını göstermek için, explan kültürlerinde ekzojen genleri eksprese etmek amacıyla laboratuvarımızda yaygın olarak kullanılan bir tekniği size göstereceğiz.Bu gösterim için, izole edilmiş organ of corti, DS red raporlaştırıcı geni konstitütif olarak eksprese eden bir ekspresyon vektörü ile elektropore edilecektir. Elektroporasyondan sonra, transfeksiyon prosedürünü geliştirmek için kültürler 24 saat boyunca few gene six transfeksiyon reaktifi ile inkübe edilecektir. Bu sistem kullanılarak, transfekte edilen hücreler 24 saat içinde sitoplazmik kırmızı floresans sergileyecektir.İlk olarak, üç mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren test tüpünde, FU gene six transfeksiyon reaktifi ile hedef DNA'yı üçe iki oranında hazırlayın. Laminar akışlı kabinde, kültür medyasını organ of horticulture'dan uzaklaştırın. Bir dakika boyunca 130 µL su ekleyin ve ardından 200 µL kapasiteli bir pipet kullanarak uzaklaştırın.Ardından, mililitre başına iki miligram plazmid DNA içeren bir stok çözeltide saklanan 30 µL DS red raporlayıcı plazmid ekleyin. Elektroporasyon için elektrik darbesi oluşturmak amacıyla BioRad gene Pulser Excel kullanıyoruz. Elektrotlar, amaçlarımıza uygun olarak atölyemizde özelleştirilmiştir; elektrotlar, 90 derecelik açıyla bükülmüş ve palet şeklinde sıkıştırılmış çıplak tellerden oluşmaktadır.Anot ve katot kültürün her iki yanında olacak şekilde, mikro manipülatör kullanarak elektrotları ilerletin. Rapor genini organ eksplant kültürüne elektropore etmek için 27 volt ve 30 milisaniye süreden oluşan 10 darbe treni oluşturun. Ardından beş dakika bekleyin.Ardından, eksplanın üzerine 130 µL FU gen altı DNA çözeltisi ekleyin ve ardından %5 CO2 varlığında 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her plakaya iki mL serumlu kültür ortamı ekleyin. Eksplan kültürleri, 24 saatten sonra altı gün veya daha uzun süre boyunca sürdürülebilir.Transfekte edilen hücreler, epi floresan mikroskobunda SI üç filtre kullanılarak gözlemlenebilir. Size organ Corte'nin izolasyonu ve birincil kültürü için bir yöntem gösterdik. Bu yöntem, embriyonik 16. gün kadar genç farelardan, kohleanın diseksiyonu zorlaştıracak kadar kalsifiye olduğu postnatal güne kadar olan farelerle uygulanabilir.Ek olarak, kültüre edilmiş corde organına ekzojen genlerin ekspresyonu için bir yöntem ortaya koyduk. Bu, kültüre edilmiş eksplan üzerinde gerçekleştirilebilecek deney türlerinden birine örnektir. Bu tekniğin şüphesiz çok sayıda kullanım alanı bulunmaktadır.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

primary-culture-plasmid-electroporation-murine-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu prosedür, birincil fare kemik iliği hematopoetik hücre kültürleri kurmak ve transfeksiyon Gene Verici MXCell elektroporasyon sistemini kullanarak takip nasıl açıklamaktadır.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Bu videoda, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC), kolorektal kanser (CRC), kolanjiokarsinom (CCC) ve mide kanseri (GC) organoidleri gibi farklı antitelerde evrensel işlevselliğini kanıtlamak için büyük plazmitlerin üç boyutlu gastrointestinal organoidlere dönüştürülmesi için elektroporasyon protokolü açıklanmaktadır.

Organoid Elektroporasyon: Plazmid DNA'yı Gastrointestinal Organoidlere Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Kaynak: Keener, D. G., et al. Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü İnhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültüründe Tek Hücreli Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. (2020).Bu video, fare hipokampal dilim kültürleri içindeki nöronlara plazmit DNA'yı sokmak için tek hücreli elektroporasyon sürecini göstermektedir. Prosedür, nöronal zarı geçici olarak geçirgen geçirgen hale getirmek ve gen transferini kolaylaştırmak için hassas pipet konumlandırma, basınç ayarlamaları ve elektroporasyon...

Fare Hipokampal Dilim Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon Yoluyla Gen İfadesi

Bu video, bir dizi in vitro hipokampal dilim kültürü boyunca hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlardaki genlerin tek hücreli elektroporasyonu için protokolü göstermektedir. Teknik, hücre otonom mekanizmaları ve transsinaptik protein etkileşimleri dahil olmak üzere nöronların spesifik moleküler ve fizyolojik fonksiyonlarını incelemek için yararlıdır.

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Tek Hücreli Elektroporasyon: Beyin Hipokampal Dilimlerinde Hedeflenen Nöronların İçine Plazmitleri Vermek İçin İn Vitro Bir Teknik

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz.  Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Burada, erken doğum sonrası farelerin korteksine nakledilen kortikal internöron atalarının aktivitesini manipüle etmek için kemogenetik araçları kullanmak üzere tasarlanmış bir protokol sıyoruz.

Erken Doğum Sonrası Fare Beyinlerine Kemogenetik Mühendislik Kortikal İnkornöron Progenitorlarının Nakli

Burada sunulan, çeşitli in vitro hipokampal dilim kültürü çağlarında hem uyarıcı hem de inhibitör nöronlarda genler sağlayabilen tek hücreli elektroporasyon için bir protokoldür. Yaklaşımımız, hücre-otonom ve hücreler arası fonksiyonları incelemek için kullanılabilecek tek tek hücrelerdeki genlerin kesin ve verimli bir şekilde ifade edilmesini sağlar.

Fare Hipokampal Uyarıcı ve Sınıfa Özgü inhibitör Nöronların Farklı Organotipik Dilim Kültürü boyunca Tek Hücreli Elektroporasyon

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Mevcut protokol, önceki protokolleri güncellemekte ve yüksek kaliteli koklear eksplantların kültürlenmesi için nispeten basit yaklaşımlar içermektedir. Bu, canlı ve sabit hücrelerde güvenilir veri toplama ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Bu protokol, iç kulak hücrelerini incelemeye yönelik devam eden eğilimi desteklemektedir.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Burada, dilimlenmiş insan kortikal organoidlerinin elektroporasyon ile akut genetik manipülasyonunu sunuyoruz. Bu kortikal organoid modeller, ventrikül benzeri yapılar dilimlemeden sonra kolayca tanımlanabildiğinden, insan kortikal gelişiminin, nörogelişimsel bozuklukların ve kortikal evrimin fonksiyonel olarak araştırılmasını sağladığından, enjeksiyona özellikle uygundur.

Gen Fonksiyonu Çalışmaları için Dilimlenmiş İnsan Kortikal Organoidlerinin Elektroporasyonu

Öğrenin, yeni doğan farelerden Corti organı izolasyonu ve kültürü ile elektroporasyon tekniğini. Bu yöntem, işitme hücreleri biyolojisi ve gen fonksiyonu çalışmaları için temel oluşturur.

İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Daha fazla video keşfet