Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Bu video, drosophila embriyolarının görüntü hemositlerine monte edilmesi için bir prosedürü göstermektedir. Embriyonik makrofajları. Embriyolar, gece boyunca bir kafeste elma suyu agar plakalarına sinekler tarafından serilir.

Ertesi gün agri plaka çıkarılır ve embriyolar, kalıntıları gidermek için ek yıkamaların ardından agri plakasından bir hücre süzgecine yıkanır. Embriyoları içeren hücre süzgeci, embriyoları kaplamak için ağartıcıya batırılır. Çamaşır suyunu yıkadıktan sonra, embriyolar bir damla suya aktarılır.

Su damlası daha sonra aspire edilir ve embriyolar merhaba karbon yağı ile kaplanır. Görünür he sitleri ile uygun şekilde evrelenmiş embriyolar, yapıştırılmış iki örtü fişi arasında zar başına bir Petri'ye aktarılır ve dikkatlice yağ içinde hizalanır. Daha sonra embriyoların üzerine üçüncü bir örtü astarı yerleştirilir ve oje ile yerine yapıştırılır.

Embriyo içindeki hemositlerin motilitesi artık mikroskopta en üstteki örtü astarı ile görüntülenebilir. Merhaba, ben Jennifer Zaed, Seul'deki Brian Strm laboratuvarından ve Kings College London'daki Moleküler Biyofizik Bölümü'nden. Ben Bath Üniversitesi Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'ndeki Wood Lab'den Ian Evans.

Bugün size Josephs bryo'yu canlı görüntüye, hemo bölgesine, bu organizmanın embriyonik makrofajlarına monte etmek için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü, bu önemli bağışıklık hücrelerine ve bu süreçleri gerçekleştirmek için kullandıkları hücre iskeleti mekanizmasına gelişimsel dağılım ve rüzgar tepkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Bu prosedüre, UAS kontrolü altında hemosit spesifik gal dört sürücü ve genetik olarak kodlanmış floresan raportörler içeren uygun TRO'lar, OAL hatları elde ederek başlayın. Burada, yılan gal dört, UAS Red Stinger'dan bir floresan kırmızı nükleer işaretleyicinin ifadesini sürmek için kullanılır. Önerilen GAL dört sürücü ve UAS yapıları hakkında bir tartışma için, lütfen ekteki yazılı protokole bakın ve her cinsiyetten 20 drosophila'yı bir döşeme kafesine yerleştirin.

Döşeme kafesi, hava akışına izin vermek için diğer ucunu gazlı bezle kaplayan plastik bir tüpün dibine takılan 55 mililitrelik bir elma suyu tarım plakasından oluşur. Alternatif olarak, delikli basit bir plastik tepe lambası kullanılabilir. Tabanı delerek, sinekler iklimlendirildikten sonra en az iki gün boyunca sineklerin yumurtlama kafesine alışmasına izin verin, yeni bir ön ısıtma elma suyu ızgarasına geçin ve sineklerin gece boyunca 25 santigrat derecede yatmasına izin verin.

Daha gizli bir şekilde aşamalı embriyoların toplanması ile ilgili bilgi için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Sinekler yumurtlama için uygun süre boyunca kuluçkaya yattıktan sonra, plakaya yaklaşık üç mililitre su uygulamak için bir yıkama şişesi kullanın. Daha sonra yumuşak uçlu bir boya fırçası kullanarak, embriyoları elma suyundan çıkarın, aate yerinden çıkmış embriyolar, bir beher üzerinde bir hücre süzgeci tutan çıplak gözle kolayca görülebilir.

Embriyoları toplamak için elma suyu suyundan gelen suyu hücre süzgecine dökün. Sonra elma suyuna daha fazla su ekleyin. Yedik. İstenilen sayıda embriyo toplanana kadar süzme işlemini tekrarlayın.

Daha sonra, bir yıkama şişesi kullanarak, embriyoları yaklaşık 10 mililitre su kullanarak hücre süzgecinde yıkayın. Embriyolar yıkandıktan sonra, hücre süzgecini elma suyu havalandırmasının kapağına yerleştirin. Embriyoları kaplamak için hücre süzgecinde embriyoları askıya alacak kadar saf ağartıcı ekleyin.

Embriyoların dekorasyonunu takip etmek için hücre süzgecini ve petri kabı kapağını bir diseksiyon mikroskobuna aktarın. Parlak alan aydınlatması altında, sırt uzantıları çözüldüğünde dekorasyon tamamlanır, bu da iki dakika içinde gerçekleşmelidir. Dekorasyon tamamlandıktan sonra, embriyoları içeren hücre süzgecini tekrar ağartıcıdan çıkarın, süzgeci bir beher üzerinde tutun.

Kalan çamaşır suyunu nazikçe ama iyice yıkamak için bir yıkama şişesi kullanın. Kalan suyu temizlemek için hücre süzgecinin alt tarafına mavi renkli laboratuvar dokuları uygulayın. Mavi renk beyaza veya pembeye dönüşürse, artık ağartıcı varsa, bir sonraki adıma geçmeden önce tüm ağartıcı kalıntılarının giderildiğinden emin olarak yıkamaya devam edin.

Hücre süzgecinden fazla suyun alınması, bir sonraki adımda embriyoların bir boya fırçası ile toplanmasını kolaylaştırır. Tüm ağartıcı embriyolardan çıkarıldıktan sonra, ince bir boya fırçası ile bir Petri kabı kapağına bir damla su koyun. Kaplanmış tüm embriyoları süzgeçten toplayın ve damlacık içinde tekrar süspanse edin.

Ardından, embriyoları kurutmak için hücre süzgecinin dışına kimyasal bir mendil uygulayın. Embriyolar kuruduktan sonra, tüm embriyoları kaplamak için 700 damla halo karbon yağı ekleyin. Daha sonra embriyoları içeren damlacığın yanına ikinci bir küçük damla yağ yerleştirin.

Embriyoları floresan diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Sitlerin lateral göçünü görüntülemek için istenen genotipin uygun şekilde evrelenmiş embriyolarını tanımlayın. Ventral orta hatta.

Evre 13 ila 14 embriyoyu seçin. Bu örnekte, sitler floresan çekirdekler tarafından tanımlanır ve embriyo üzerinde dağılmayı takiben hemosun motilitesini görüntülemek için başta ve ventral sinir kordonu ve gelişmekte olan dorsal damar boyunca görülebilir, evre 15 embriyoları seçin. Bu aşamada, hemos tüm embriyoya dağılmış olacaktır.

Bununla birlikte, orta hattan lateral göçü takiben embriyonun ventral tarafında üç paralel hemos çizgisi görünmelidir. Embriyolar seçildikten sonra, seçilen embriyoları toplamak için bir çift kavisli beş numara saatçi forseps kullanın. Flakon zarlarını delmemeye dikkat edin.

Daha sonra embriyoları 50 milimetrelik bir Petri perma lumax kabının alt tarafındaki ikinci yağ damlasına yerleştirin. Yaklaşık bir santimetre aralıklarla iki küçük damla Halo Caron yağı 700 yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobunda parlak alan aydınlatması altında her damlaya bir kapak fişi uygulayın.

Kavisli forseps kullanarak 15'e kadar embriyoyu dikkatlice aktarın. Embriyoların ventral tarafı yukarı ve kapağın kenarına paralel olarak hizalanması. Embriyolar küçük bir yağ damlasıyla hizalandıktan sonra kayar ve iki örtü fişi arasında homojen bir tabaka oluşturacak şekilde yayılmasına izin verir.

Yağ yayıldıktan sonra bu işlem birkaç dakika sürebilir. Embriyoların hala ventral olup olmadığını kontrol edin. Embriyolar hafifçe yuvarlanmışsa yukarı doğru kaydırın.

Onları forseps ile tekrar konumlandırın. Sonunda üç numaralı cımbız kullanarak. Embriyoların üzerine üçüncü bir örtü fişi yerleştirin.

Önceden yapıştırılmış iki kapak fişi arasında köprü kurmak. Bu kapak fişini kapağa yapıştırın. Oje kullanarak kayma destekleri.

Embriyolar artık görüntüleme için hazırdır. Bu SRP gal dört UAS Red Stinger embriyosu ventral tarafı yukarı bakacak şekilde monte edildi ve Leica M 2 0 5 floresan diseksiyon mikroskobunda hızlandırılmış görüntüler elde edildi. O sitler, kırmızı etiketli çekirdekleri ile görselleştirilir.

Film, gelişimin 12. ila 13. aşamasında, he sitlerinin kafayı terk edip ventral orta hatta doğru göç etmesiyle başlar. Yaklaşık bir saat sonra, sitler ventral yüzey boyunca yanal pozisyonlara dağılmak için orta hattan göç etmeye başlar. Geliştirmenin geri kalanı için.

Hemositler oldukça aktiftir ve embriyo boyunca göç eder. Hareketi veya hemo tarafını canlı olarak in vivo olarak takip etmek için Joseph embriyosunu nasıl izleyeceğinizi size göstermeliyiz. Bu prosedürü yaparken, embriyolar yağa girdikten sonra zarar görmemek için embriyoları dikkatli bir şekilde ele almak önemlidir, dehidrasyona nispeten dirençlidirler, ancak corion'u çıkarırken embriyoları çok uzun süre ağartmamaya özen gösterilmelidir.

Son olarak, birkaç embriyoyu monte ederek, canlı görüntüleme için mükemmel yönde bir embriyo elde etmek için kendinize mümkün olan en iyi şansı vereceksiniz. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.