Name: Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-12T18:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster embriyolarında hemosit göçünü canlı görüntüleme yöntemini. Bu protokol bağışıklık hücrelerinin gelişimsel dinamiklerini incelemek için kullanılır ve araştırmacılara embriyonik makrofaj davranışları hakkında önemli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol, Paul Martin ve Antonio Jacinto laboratuvarları ile işbirliği içinde ve çalışma ile geliştirilmiştir. Biz Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi sinek satırları paylaşmak için devam etmek için mükemmel servis ve Drosophila topluluk için teşekkür ederiz . BS BBSRC bir proje hibe ile finanse edilmektedir. WW, Wellcome Trust Kariyer Geliştirme Bursu tarafından finanse edilmektedir.

Hazırlık <ol><li> Hemocyte özel bir Gal4 sürücüsü (örneğin srp-Gal4 2) ve genetik olarak kodlanmış UAS kontrol (örneğin UAS-GFP) altında bir floresan muhabiri içeren uygun Drosophila hatları alın. Srp-Gal4 UAS-GMA 3 veya CRQ-Gal4 UAS-GFP 4, 5, homozigot Sinekler görüntüleme amaçlı (nb GMA moesin aktin bağlayıcı etki alanı için erimiş GFP) yararlıdır; bir tartışma için aşağıya bakınız Gal4 sürücüleri ve UAS aralığı (Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi, geniş bir çeşitlilik içerir) oluşturur. </li><li> Genelde genetik haçlar, mutant allel Gal4 sürücüleri ve alternatif kromozomlar üzerinde taşınan UAS yapıları ile, floresan dengeleyici CTG veya TTG 6 kullanarak dengeli yürütülmektedir. Bu CTG / TTG ilişkili GFP floresan (bu aşamada 2.11 yapılır) yokluğu temelinde homozigot mutantlar seçmek mümkün kılar. </li><li> Bir elma suyu agar plaka 7 ile döşeme kafes, hisse senetleri ve yer sinekler artırın . Sinekler yeterli embriyolar döşenecek başlamadan önce döşeme kafes iklime alıştırmak için en az iki gün gerekir. Genel olarak her seks yirmi sinekler görüntüleme için yeterli embriyolar üretmek için yeterli olmalıdır, ancak farklı çizgiler, bereket derece farklı olduğunu belirtmek gerekir. Biz hava akımına izin tabanı delinmiş, plastik bir kabın alt içine sığacak 55mm Petri kapları kullanın. Tam embriyo toplama aracı önemsiz, ancak zamanlamaları embriyolar sahnelenen doğru toplamak için kritik öneme sahiptir. </li><li> 25 ° C'de veya zamanlanmış bir plaka tutulan bir gecede elma suyu agar plaka embriyolar toplayın. Ikincisi için biz genellikle sinekler plaka kaldırma ve embriyo montaj önce 15-16 saat 18 ° C'de yerleştirmeden önce, 4 saat önceden ısıtılmış bir plaka üzerinde bırakmaya izin verir ve bu geç dönem 12 ile embriyolar sağlar gelişme 15 sahne. Bir gecede plaka aşamaları büyük bir çeşitlilik içerir, ancak 25 kez daha uzun bir süre nedeniyle hemocytes floresan muhabir ifade daha yüksek düzeyde avantaj sunuyor ° C Gal4 UAS sistemi olarak ısıya duyarlı. </li></ol> Prosedür <ol><li> Küçük bir miktar su ve yumuşak uçlu bir fırça kullanarak elma suyu agar plaka embriyolar yerinden oynatın. Yerinden çıkar embriyolar çıplak gözle kolayca görülebilir. </li><li> Bir hücre süzgeç (Balıkçı) ya da ev yapımı elma suyu agar plaka, atık su toplamak için bir beher üzerinde yapılan sepetin içine su dökerek sepeti 7 embriyo transfer </li><li> Eğer elma suyu agar plaka transfer yeterli embriyolar memnun olana kadar 2.2 adımı tekrarlayın. </li><li> Su kullanarak hücre süzgecinden / sepeti embriyolar yıkayın. </li><li> Yer hücre süzgecinden / sepet elma suyu agar plaka Petri kabı kapağı ve hücre süzgecinden / sepete embriyolar askıya almaya yetecek kadar düzgün çamaşır suyu ekleyin. </li><li> Aydınlık altında diseksiyon mikroskobu embriyoların dechorionation izleyin: dechorionation iki dakika içinde gerçekleşmesi gereken, tamamlandığında dorsal uzantıları çözünmüş. </li><li> Çamaşır suyu hücre süzgecinden / sepet içeren embriyolar çıkarın ve kalan çamaşır suyu su kullanarak yıkayın. Çamaşır suyu tüm izlerini 2.8 adıma geçmeden önce çıkarılmalıdır. Artık çamaşır suyu mavi renk pembe / beyaz ağartılmış varsa çamaşır suyu kaldırıldı olup olmadığını değerlendirmek için bir hile, mavi renkli laboratuvar dokular üzerinde kalan su örtecek. </li><li> Kalan su hücre süzgecinden / sepeti alt uygulanan laboratuar doku / mediwipes kullanarak kurutun. </li><li> Petri kabı kapağı bir damlacık su koyun. Ince bir fırça ile tüm dechorionated embriyolar, embriyo sepeti toplamak ve damlacık onları tekrar süspansiyon haline getirin. Sonraki mikropipet kullanarak su aspire veya dikkatli bir laboratuvar doku / mediwipes emici embriyolar kurulayın. </li><li> Embriyoların kurutulduktan sonra, tüm embriyoların voltalef petrol bir damla ekleyin. Embriyoları içeren damlacık bitişik ikinci bir küçük bir damla yağ koyun. NB biz İngiltere'de bir voltalef petrol tabanlı ticaret bulamadı; Halokarbon petrol 700 (Sigma) yerine kullanılıyor olabilir. </li><li> Uygun bir floresan diseksiyon mikroskobu altında yağ damlacığı saatçiler forseps bir çift (sayı 5) kullanarak istenilen genotip embriyolar sahnelenen seçin. Bu forseps kendi vitellin membran delinmesiyle embriyolar kepçe için içe doğru kıvrıktır (Şekil 1) olmalıdır. Ikinci petrol damlacığı seçilen embriyolar transfer. Konfokal mikroskop (Şekil 2) iyi görüntüler toplamak mümkün olması için diseksiyon mikroskobu floresan hemocytes görmek mümkün olduğu önemlidir. Biz genellikle ventral orta hat veya sahne 15 embriyolar hemocytes görüntü yanal göç monte sahne 13/14 embriyolarmotilite hemocytes embriyo üzerinde dağılımı aşağıdaki görüntü. </li><li> (Şekil 3) arasında yaklaşık 1 cm bırakarak voltalef yağı 2 küçük damla kullanarak bir Petriperm / Lumox çanak (Sarstedt) alt iki lamelleri (18x18mm, kalınlık 1), Çubuk, bu lamel üzerine yerleştirilen bir destek için kullanılacak embriyoların onları ezmek için değil. Petriperm yemekleri (50mm çap), hidrofobik, gaz geçirgen bir zar içerir. Biz yemekleri (yemekler% 70 etanol ile silinir ve yeniden olabilir) birkaç kez kullanıldıktan sonra kullanımı daha kolay hale gelir. </li><li> Diseksiyon mikroskobu aydınlık altında, bükülmüş forseps ve hat ventral tarafta seçilen embriyolar tek tek pick up ve paralel lamelleri kenarına (Şekil 3). Beceri ve sabrınız bağlı olarak, bu şekilde 15 kadar embriyolar hizalamak mümkündür. Embriyo ve Petriperm çanak membran hem kırılgan olduğu ve kolayca rüptüre olabilir hafifçe embriyolar işlemek için önemlidir. </li><li> Bir kere küçük bir damla yağ ekleyin ve iki lamelleri arasında homojen bir tabaka oluşturacak şekilde yayılır izin embriyoların hizalanır. Petrol yayıldı sonra (bu birkaç dakika sürebilir) embriyoların hala ventral tarafta olup olmadığını kontrol edin. Embriyoların biraz haddelenmiş varsa, forseps ile onları tekrar yeniden konumlandırmak. </li><li> Son olarak, cımbız (3 numara) iki önceden yapıştırılmış lamelleri üzerine oturtulmuş embriyolar üzerinde lamel (18x18mm, kalınlık 1) kullanarak. Tutkal lamel Bu lamel oje (Şekil 3) kullanılarak destekler. </li><li> Konfokal veya geniş alan mikroskobu monte embriyolar Petriperm çanak alın ve uygun bir adaptörü kullanarak sahnede Petriperm çanak montaj. Dik veya ters çevrilmiş bir mikroskop lamel (zarından aksine) odaklı objektif lens ile kullanılıyor olabilir Ya. </li></ol> Temsilcisi Sonuç: Bu protokol, embriyonun ventral tarafında hemocytes canlı görüntüleme için Drosophila embriyolar monte anlatılmaktadır. Eğer doğru yapılırsa hemocytes, fotoğraf ya da film ya da oluşturmak için kolay olacaktır. Hemocytes (özellikle objektif lens) görüntü için kullanılan en önemli belirleyicisi mikroskop, ancak elde edilen görüntülerin niteliği de geliştirme aşamasında bağlıdır, sıcaklık embriyoların kaldırdı ve Gal4 ve UAS hatları kullanılır. Floresan protein ekspresyonu yüksek seviyelerde hemocytes daha kolay bir şekilde görüntülü olmasını sağlayacak, bu nedenle, embriyoların (Şekil 2 ile alınan embriyoların içinde açık hemocytes örnekleri içeren protokol aşamasında 2.11 hemocytes görmek mümkün önemlidir. kamera) bir diseksiyon mikroskobu takılmıştır. Gal4 ve UAS yapıları nedenle artan sayıda, daha büyük bir sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, bu da hemocyte davranış sağlayan görüntüleme, daha uzun süre takip edilmesi gereken yüksek lazer şiddetleri artan pozlama süreleri ihtiyacını azaltır. GFP ifade çok yüksek seviyede, surround yuvarlak hücre gövdesi (Şekil 4A-B), özellikle ince bir tabaka gibi lamel hemocyte morfolojisi ince ayrıntılarına kadar gösterecektir. GFP hariç Dairesel bölgelerde phagosomes (Şekil 4A-C) temsil eder. Lamel (Şekil 4B) çıkan filopodia-gibi Parmak de görülebilir. İki Gal4 sürücüleri (tartışma) bir veya daha fazla srp-Gal4 özellikle bu işlemler (Şekil 4C) görmek için yeterli kalır, ancak konfokal mikroskop yavaş tarama hızları veya daha fazla lazer güç gerekli olabilir. Ekspresyon düzeylerinde azalma gibi görüntü hemocytes, çıkıntılar daha zor olur; yine de bu çıkıntılar daha az belirgindir (Şekil 4D) bile hücre gövdesi ve açık kaldığı sürece, bu koşullar altında hemocytes göç izlemek için hala mümkündür. Önceki gelişim aşamaları (en fazla 13 sahne) hemocytes birbirleriyle yakın temas halinde göç eden ve tek tek hücrelerin ayırt etmek genellikle zordur. Aşamasının sonuna gelindiğinde 13 hemocytes ventral orta hat (Şekil 5A) aşağı tek bir satır oluşturdular, sonra, daha fazla hareketli olma, ventral sinir kablosu (Şekil 5B) kenarlarına yanal göç. Hemocytes dinamik çıkıntılar içinde aktin hücre iskeletinin GMA (Şekil 5C) veya kiraz moesin ifade aracılığıyla doğrudan görülebilir. Bu şekilde embriyoların Montaj gaz değişimi sağlar ve dehidratasyonu engeller ve embriyolar yaşayabilir aşağıdaki görüntü kalır. Embriyo, embriyo içerik, vitellin zarından sızıntı olarak genellikle açıktır montaj sırasında hasar görmüşse. Bir embriyo sonra kurutmak Eğer bu genellikle vitellin membran deformasyonlar görülmüştür. Bazen bir embriyo timelapse film seyri sırasında rulo, ancak bu sadece uzun zaman ölçeğinde filmler için sorunlu olma eğilimindedir. Lastly, aynı anda birden fazla embriyoların montaj experimentalist kendi deney için mükemmel bir yönde bir embriyo elde etmek için en iyi şansı verir. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Dechorionated embriyo manipülasyonu için Forseps. Saatçiler forseps (boyut numarası 5) ipuçları moda için bir araç, burada gösterildiği gibi embriyolar kadar kepçe bükük içe olmalıdır. Ponksiyon embriyo hiçbir keskin kenarlara sahip olarak bükülmüş bölgenin dış yüzeyi de Petriperm membran konumlandırma sırasında embriyoların işlemek için yararlıdır. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Iyi canlı görüntüleme sonuçlar verecektir embriyolar Temsilcisi görüntüler. Voltalef yağ dechorionated embriyolar (protokol 2.11 sahne) Görüntüler floresan diseksiyon mikroskobu alınan. CRQ Gal4, UAS-GFP embriyolar; aşamada 13 (A) ve sahne 15 (B) srp-Gal4, UAS-GFP Yanal manzaralı. Hangi bir sahne 15 srp-Gal4, UAS-GFP / + Yanal; CRQ-Gal4 uas-GFP/uas-N17Rac embriyo (C) hemocytes zaman hemocytes gibi neye embriyolar gösteren, kafasının dışına göç başarısız oldu onların göç yolları üzerinde belirgin değildir. Geliştirme (D) Bu aşamada gut dolambaçlı bir yapı gösteren CRQ Gal4, UAS-GFP embriyo; bir sahne 17 srp-Gal4, UAS-GFP Yanal görünümü kas kasılması başlangıcı bunun ötesinde embriyoların canlı görüntüleme önler gelişme aşamasında. Ventral aşamada 13 (E) ve sahne 14 kez (F) srp-Gal4, floresan etiketli çekirdekleri ile hemocytes yayılma gösteren UAS-kırmızı stinger embriyolar. Protokol aşamasında 2.11 floresan hemocytes Gözlem mükemmel görüntüler elde etmek için bir ön koşuldur; anterior tüm görüntüleri için doğru. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Embriyoların Petriperm / Lumox çanak montajı. İki 18x18mm lamelleri (kalınlığı 1) gösterildiği gibi yaklaşık 1cm ayrılmış küçük bir damla petrol kullanarak Petriperm çanak alt yüzüne yapışmış. Embriyolar sonra lamelleri kenarları uzun (ön-arka) eksenine paralel ventral tarafta kadar astarlı ve küçük bir damla yağ ile kaplıdır. Bir kez üçüncü bir lamel (18x18mm kalınlığı 1) hafifçe ezilmiş olan embriyolar önlemek için bir köprü olarak iki önceden yapıştırılmış lamelleri kullanarak yağ kaplı embriyoların üstüne yerleştirilen iki lamelleri arasındaki boşluğu doldurmak için petrol yayıldı. Bu lamel sonra oje iki küçük damla kullanarak iki lamel köprüler yapıştırılır. Bir kez ayarlandığında, embriyoların lamel (Petriperm zarından aksine) aşağı doğru odaklama objektif lens ile Dik veya ters çevrilmiş bir mikroskop görüntülenebilir. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. GFP etiketli hemocytes canlı görüntüleme Temsilcisi sonuçlar. CRQ Gal4, UAS-GFP embriyo (AB); bir sahne 14 srp-Gal4, UAS-GFP ventral tarafta hemocytes Z-projeksiyonları. (A) timelapse filmlerde hemocyte gelişimsel göçleri izlemek için kullanıldığı gibi daha düşük bir büyütme görüntü. (B) kendi morfolojisi ince ayrıntılarını gösteren, ventral orta hat hemocytes hala daha yüksek bir büyütme. (C), ventral orta hat üzerinde bir sahne 14 srp-Gal4, UAS-GFP / + hemocytes 1 m tek bir dilim CRQ-Gal4 UAS-GFP / + embriyo, ifşa Gal4 sürücüleri ve UAS düşük kopya sayısı yapıları da iyi bir görüntü oluşturmak için yeterlidir. (D) bir sahne 14 CRQ-Gal4, UAS-GFP embriyo hemocytes z-projeksiyon görüntüler. Burada hemocyte çıkıntılar nedeniyle, GFP, düşük ifadesi daha az belirgin ama film yapmak ve bu kombinasyon inşa Gal4 sürücü ve kullanıcı arayüzleri ile hemocyte göç izlemek için hala mümkün. Görüntüler Leica LSM510 konfokal mikroskop alındı ​​anterior tüm görüntüler; görüntülerin çevre halkalar vitellin membran otofloresans kaynaklanır. <img src="/files/ftp_upload/1696/1696fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. GMA ifade hemocytes canlı görüntüleme Temsilcisi sonuçlar. Evre (13), ventral orta hat (A) ve sahne 14 hemocytes Z-projeksiyonları (B) srp-Gal4 UAS-GMA embriyolar hemocytes gelişimsel göçler göstermek için timelapse filmleri alınmıştır. GMA ifade hemocytes (C) daha yüksek büyütme görüntüleme aktin dinamikleri hakkında detaylı bilgi elde edilebilir. GMA moesin ve etiketler aktin filamentler aktin bağlayıcı etki alanı erimiş GFP oluşur. Anterior tüm görüntüler; konfokal mikroskop görüntüleri alındı.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF%2FVEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7, 73-84 (2004).</li>
<li>Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+morphogenetic+movements+in+Drosophila+using+Gal4-UAS-driven+expression+of+GFP+fused+to+the+actin-binding+domain+of+moesin%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin.</a> Genesis. 34, 146-151 (2002).</li>
<li>Stramer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li>
<li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes%3A+masters+of+multitasking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li>
<li>Halfon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+fluorescent+protein+reporters+for+use+with+the+Drosophila+Gal4+expression+system+and+for+vital+detection+of+balancer+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes.</a> Genesis. 34, 135-138 (2002).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2000).</li>
<li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120, 1829-1837 (1994).</li>
<li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135, 621-626 (2008).</li>
<li>Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+PAR-1+in+regulating+the+polarised+microtubule+cytoskeleton+in+the+Drosophila+follicular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium.</a> Development. 130, 3965-3975 (2003).</li>
<li>Olofsson, B., Page, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condensation+of+the+central+nervous+system+in+embryonic+Drosophila+is+inhibited+by+blocking+hemocyte+migration+or+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity.</a> Dev Biol. 279, 233-243 (2005).</li>
<li>Paladi, M., Tepass, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Rho+GTPases+in+embryonic+blood+cell+migration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila.</a> J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).</li>
<li>Vlisidou, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+embryos+as+model+systems+for+monitoring+bacterial+infection+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time.</a> PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).</li>
<li>Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+actin-based+epithelial+adhesion+and+cell+matching+during+Drosophila+dorsal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure.</a> Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).</li>
<li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+movement+during+dorsal+closure+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos.</a> Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).</li>
<li>Kunwar, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tre1+GPCR+initiates+germ+cell+transepithelial+migration+by+regulating+Drosophila+melanogaster+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin.</a> J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).</li>
</ol>

Bu prosedürün en önemli unsurlardan açıkça etiketli hemocytes sağlıklı embriyoların seçimi ve onlara zarar vermeden bunları dikkatli bir şekilde monte etmek için. Birkaç saat süreyle imaged embriyoların Halokarbon yağı sonra dehidratasyon dayanıklı ve bir kez monte edilebilir. Bizim ellerde 40X amacı ile her üç dakikada bir Zeiss LSM510 konfokal mikroskop görüntüleri z yığını alarak, embriyo ya da açık foto-hasar ihmal dehidratasyon üç saat görüntü hemocytes,. Hemocytes son derece dinamik olduğu için mekansal ve zamansa...

<table><tbody><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>70&amp;#x03BC;m gözenekler</td></tr><tr><td>Halcarbon yağı 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Lumox/Petriperm plak</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>96077305</td><td></td></tr></tbody></table>

uygulamalarda canlı görüntüleme drosophila melanogaster embriyonik hemocyte göçler

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Birçok çalışma, adres hücre göçü<em&gt; In vitro</em&gt; Yöntemleri, fizyolojik ilgili çevre ise organizmanın kendini. Burada montaj için bir protokol<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Embriyo ve floresan etiketli hemocytes sonraki canlı görüntüleme, bu organizmanın embriyonik makrofajlar. Gal4 UAS sistemini kullanarak<sup&gt; 1</sup&gt; Embriyo boyunca gelişimsel dağılma takip hemocytes genetik olarak kodlanmış, floresan etiketli işaretleyicileri çeşitli ifadesi sürücü. Embriyo gelişiminin istenilen aşamada aşağıdaki toplama, dış koryon kaldırılır ve embriyoların daha sonra bir hidrofobik, gaz geçirgen bir zar ve canlı görüntüleme için bir cam lamel arasında Halokarbon yağ monte edilmiştir. Hız ve yönlülük, F-aktin ve mikrotübüller bu sitoskeletal bileşenlerin dinamikleri ile ilgili daha detaylı bilgi verebilir floresan gazetecilere kullanımı ile birleştiğinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme gibi brüt göçmen parametrelere ek olarak.

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Birçok çalışma, hücre göçünü in vitro yöntemler kullanarak ele almaktadır; ancak fizyolojik açıdan ilgili olan ortam, organizmanın kendisidir. Burada biz ...

Bu video, hemositleri, yani embriyonik makrofajları görüntülemek için drosophila embriyolarının monte edilme prosedürünü göstermektedir. Embriyolar, sinekler tarafından bir yumurtlama kafesi içinde, gece boyunca elma suyu agar plaklarına bırakılır.Ertesi gün agri plaka çıkarılır ve kalıntıları temizlemek için yapılan ek yıkamaların ardından embriyolar, agri plakadan bir hücre süzgecine yıkanır. Embriyoları içeren hücre süzgeci, embriyoları kaplamak için çamaşır suyuna daldırılır. Çamaşır suyu yıkandıktan sonra embriyolar bir su damlacığına aktarılır.Ardından su damlası aspire edilir ve embriyolar karbon yağı ile kaplanır. Görünür blastomerleri olan uygun evredeki embriyolar, iki sabitlenmiş lamel arasındaki bir Petri membranına aktarılır ve yağ içerisinde dikkatlice hizalanır. Daha sonra embriyoların üzerine üçüncü bir lamel yerleştirilir ve oje ile sabitlenir.Embriyodaki hemositlerin motilitesi artık bir mikroskop altında, en üstteki lam aracılığıyla görüntülenebilir. Merhaba, ben Kings College London'daki Hücresel ve Moleküler Biyofizik bölümü ile Brian Strm laboratuvarından Jennifer Zaed. Ben de Bath Üniversitesi Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'ndeki Wood Lab'den Ian Evans.Bugün size, bu organizmanın embriyonik makrofajları olan hemo sitlerin canlı görüntülemesi için Josephs bryo'nun montaj prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, bu önemli bağışıklık hücrelerinin gelişimsel dağılımını, çevreye verdikleri yanıtları ve bu süreçleri gerçekleştirmek için kullandıkları hücre iskeleti mekanizmalarını incelemek amacıyla kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Bu prosedüre, hemosit spesifik gal four sürücüleri ve UAS kontrolü altındaki genetik olarak kodlanmış floresan raporlar içeren uygun TROs OAL hatlarını temin ederek başlayın. Burada, UAS Red Stinger'dan floresan kırmızı bir nükleer markörün ekspresyonunu yürütmek için serpent gal four kullanılır. Önerilen GAL four sürücüleri ve UAS konstrüktlarının kapsamı hakkındaki tartışma için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız; her cinsiyetten 20 drosophila'yı bir yumurtlama kafesine yerleştirin.Yumurtlama kafesi, alt kısmı 55 mililitre elma suyu içeren bir agri plakasına monte edilmiş, hava akışını sağlamak için diğer ucu gazlı bezle kapatılmış plastik bir tüpten oluşur. Alternatif olarak, tabanına delikler açılmış basit bir plastik huni de kullanılabilir. Sineklerin yumurtlama kafesine en az iki gün boyunca alışmasına izin verin; sinekler adapte olduktan sonra yeni, önceden ısıtılmış bir elma suyu plakasıyla değiştirin ve sineklerin 25 °C'de gece boyunca yumurtlamasına izin verin.Daha belirgin evrelerdeki embriyoların toplanmasına ilişkin bilgi için lütfen beraberindeki yazılı protokole bakınız. Sinekler, yumurta bırakma için uygun süre boyunca inkübe edildikten sonra, bir yıkama şişesi kullanarak plaka üzerine yaklaşık üç mililitre su uygulayın. Ardından, yumuşak uçlu bir boya fırçası kullanarak embriyoları elma suyundan ayırın; bir beherin üzerine hücre süzgeci tutarak ayrılan embriyolar çıplak gözle kolayca görülebilir.Embriyoları toplamak için elma suyu aate içindeki suyu hücre süzgecine dökün. Ardından elma suyu aate'ye daha fazla su ekleyin. İstenen sayıda embriyo toplanana kadar süzme işlemini tekrarlayın.Ardından, bir yıkama şişesi kullanarak, hücre süzgecindeki embriyoları yaklaşık 10 mililitre su ile yıkayın. Embriyolar yıkandıktan sonra, hücre süzgecini elma suyu Aerate kapağına yerleştirin. Embriyoları kaplamak için, hücre süzgecindeki embriyoları askıda tutacak miktarda saf çamaşır suyu ekleyin.Embriyoların dekortikasyonunu takip etmek için hücre süzgecini ve petri kabı kapağını bir diseksiyon mikroskobuna aktarın. Aydınlık alan aydınlatması altında, dorsal uzantılar çözündüğünde dekortikasyon tamamlanmış olur ve bu işlem iki dakika içinde gerçekleşmelidir. Dekortikasyon tamamlandıktan sonra, embriyoları içeren hücre süzgecini, süzgeci tekrar bir beherin üzerinde tutarak çamaşır suyundan çıkarın.Kalıntı çamaşır suyunu nazikçe ancak tamamen yıkamak için bir yıkama şişesi kullanın. Kalan suyu kurulamak için hücre süzgecinin alt kısmına mavi renkli laboratuvar mendilleri uygulayın. Mavi renk beyaza veya pembeye dönerse, kalıntı çamaşır suyu mevcut demektir; bir sonraki adıma geçmeden önce tüm çamaşır suyu izlerinin giderildiğinden emin olarak yıkamaya devam edin.Hücre süzgecindeki fazla suyun uzaklaştırılması, bir sonraki adımda embriyoların bir resim fırçasıyla toplanmasını kolaylaştırır. Embriyolardaki tüm çamaşır suyu uzaklaştırıldıktan sonra, bir Petri kabı kapağına ince bir resim fırçası yardımıyla bir damla su yerleştirin. Kaplanmış tüm embriyoları süzgeçten toplayın ve su damlası içinde yeniden süspande edin.Ardından, embriyoları kurulamak için hücre süzgecinin dış kısmına bir kimyasal temizleme bezi uygulayın. Embriyolar kurutulduğunda, tüm embriyoları kaplayacak şekilde bir damla halokarbon yağı, 700 ekleyin. Daha sonra, embriyoları içeren damlacığın yanına ikinci bir küçük yağ damlası yerleştirin.Embriyoları floresan diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Ventral orta hatta hemositlerin lateral migrasyonunu görüntülemek için istenen genotipte ve uygun evredeki embriyoları belirleyin.13 ila 14. evre embriyoları seçin. Bu örnekte, hemositler floresan çekirdekler aracılığıyla tanımlanmıştır ve baş kısmında, ventral sinir kordonu boyunca ve gelişmekte olan dorsal damarda görünür durumdadır; hemositlerin embriyo üzerine dağılımı sonrası motilitesini görüntülemek için 15. evre embriyoları seçin. Bu evrede hemositler, embriyonun tamamına yayılmış olacaktır.Bununla birlikte, orta hattan yanlara göçün ardından embriyonun ventral tarafında üç paralel hemos hattı görünür olmalıdır. Embriyolar seçildikten sonra, seçilen embriyoları toplamak için bir çift kavisli beş numara saatçi penseti kullanın. Flakon membranlarını delmemeye özen gösterin.Ardından embriyoları, 50 milimetrelik bir Petri perm lumax kabının alt yüzeyindeki ikinci yağ damlasına yerleştirin. Yaklaşık bir santimetre ara ile iki küçük Halo Caron oil 700 damlası koyun. Bir diseksiyon mikroskobunda, parlak alan aydınlatması altında her bir damlanın üzerine bir lameli örtün.Kavisli pens kullanarak 15 adede kadar embriyoyu dikkatlice aktarın. Embriyoları ventral tarafları yukarı bakacak şekilde ve lamelin kenarına paralel olarak hizalayın. Embriyolar hizalandığında, küçük bir damla yağ ekleyin ve yağın iki lamel arasında homojen bir tabaka oluşturacak şekilde yayılmasını sağlayın.Yağ yayıldıktan sonra, bu işlem birkaç dakika sürebilir. Embriyoların hâlâ ventral konumda olduğunu kontrol edin. Embriyolar hafifçe dönmüşse yan taraflarını yukarı getirin.Onları pensle tekrar yeniden konumlandırın. Son olarak, üç numaralı cımbız kullanarak embriyoların üzerine üçüncü bir lamelle örtük kapatın.Önceden yapıştırılmış iki lamı birbirine bağlayın. Bu lamı kapağa yapıştırın. Oje kullanarak lam desteklerini sabitleyin.Embriyolar artık görüntüleme için hazırdır. Bu SRP gal four UAS Red Stinger embriyosu ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirilmiş ve zaman ayarlı görüntüler bir Leica M 2 0 5 floresan diseksiyon mikroskobunda elde edilmiştir. Hemositler, kırmızı işaretli çekirdekleri aracılığıyla görselleştirilmiştir.Video, hemostitlerin kafadan ayrılıp ventral orta hat boyunca aşağıya doğru göç ettiği gelişimin 12. ila 13. evresinde başlar. Yaklaşık bir saat sonra, hemostitler ventral yüzey boyunca lateral pozisyonlara dağılmak için orta hattan uzaklaşmaya başlar. Gelişimin geri kalanında.Hemositler oldukça aktiftir ve embriyo boyunca göç ederler. Joseph embriyosunun nasıl izleneceğini, böylece hemositlerin in vivo canlı hareketlerinin nasıl takip edileceğini size göstermeliyiz. Bu prosedür uygulanırken, özellikle petri kabı üzerindeyken embriyoların zarar görmemesi için dikkatli davranılması önemlidir; embriyolar yağ içine alındığındale dehidrasyona karşı nispeten dirençli hale gelirler, ancak koriyon çıkarılırken embriyoların çok uzun süre ağartılmamasına özen gösterilmelidir.Son olarak, birkaç embriyo yerleştirerek, canlı görüntüleme için mükemmel yönelime sahip bir embriyo elde etme şansınızı en üst düzeye çıkarmış olacaksınız. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

live-imaging-of-drosophila-melanogaster-embryonic-hemocyte-migrations

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Kaynak: Hiroyasu, A. ve diğerleri. Drosophila melanogaster larvalarından hemositlerin mikrobiyal enfeksiyon ve analiz için ekstraksiyonu. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, Coxiella burnetii ile enfekte olmuş Drosophila melanogaster hemositlerinin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesini sunarak patojenin lokalizasyonunu 3D olarak görselleştirerek hücre içi enfeksiyon dinamikleri ve konak-patojenler etkileşimlerinin ayrıntılı analizini mümkün kılmaktadır.

Patojen Enfekte Drosophila Hemositlerinin Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Görüntülemesi

Source: Hellerman, M. B., et al. Drosophila Pupa Gözünün canlı görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Video, bir Drosophila melanogaster pupasında göz desenini incelemek için canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli belirteçler, gelişmekte olan göz yapısının oluşumu sırasında hücresel organizasyonun ve farklılaşmanın görselleştirilmesini sağlar.

Floresan mikroskobu kullanılarak Drosophila pupa gözünün canlı görüntülenmesi

Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem...

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Drosophila kan hücreleri veya hemositler, yerleşik bölgeler ve dolaşım arasında döngü yapar.  Larvada, yerleşik (sapsız) hemositler indüktif mikro ortamlara, Hematopoetik Ceplere lokalize olurken, dolaşımdaki hemositler hemolenf içinde serbestçe hareket eder. Bu protokolün amacı, davranışsal olarak farklı ancak birbirini değiştiren bu iki hemosit popülasyonunun standartlaştırılmış izolasyonu ve miktarının belirlenmesidir.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Burada yüksek spatio-zamansal çözünürlük vivo içindecanlı görüntüleme yara onarım ve ilişkili inflamatuar yanıt için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yöntem uzun vadeli görüntüleme ve belirli hücre popülasyonlarının zaman içinde izleme etkinleştirmek için Drosophila geliştirme pupa aşaması kullanır ve verimli RNAi aracılı gen inactivation ile uyumludur.

İnflamatuar hücre dinamiği Drosophila pupa içinde uzun vadeli Vivo içinde izleme

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin Drosophila melanogaster embriyolarında hemosit göçünü canlı görüntüleme yöntemini. Bu protokol bağışıklık hücrelerinin gelişimsel dinamiklerini incelemek için kullanılır ve araştırmacılara embriyonik makrofaj davranışları hakkında önemli bilgiler sunar.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Daha fazla video keşfet