Name: Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-15T16:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Öğrenin canlı Drosophila melanogaster'in moleküler karakterizasyonu için yüksek çözünürlüklü manyetik açılı dönüşlü proton MR spektroskopisi (HRMAS 1H-MRS) yöntemini. Bu teknik metabolik süreçleri incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Laurence G. Rahme Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) hibe AI063433, Ronald G. Tompkins (A. Aria Tzika Müdürü Sağlık Ulusal Enstitüsü Enstitüleri (NIH) Merkezi Grant (P50GM021700) tarafından kısmen desteklenmiştir. Çocuklar araştırma bursu (8893) A. Aria Tzika NMR çekirdek) ve Shriner Hastanesi. Biz Dionyssios Mintzopoulos doktora teşekkür Bu protokol ve Ovidiu C. Andronesi doktora geliştirme ilk aşamalarında yardım için TOBSY darbe dizisi ile ilgili yardım için.

Bölüm 1: HRMAS Ölçümler için hazırlanması Drosophila <ol><li> Standart flylab prosedürleri kullanma 1, 3 gün boyunca yeni sinekler eclosing ve taze sinek gıda içeren şişeleri uçmak için transfer toplamak. Sineklerin sadece deneme için 5-8 gün önce eski haline gelecektir ki, 5 gün boyunca toplanan sinekler inkübe edin. Sadece bir cinsiyet (genellikle erkek), deneyler için kullanılır. </li><li> Sağlıklı, bozulmamış vahşi tip örneğin, travmatize olmuş ya da genetik olarak değiştirilmiş sinek 1 tedavi ile karşılaştırmak için uçar. </li><li> Tek sinek sinek gıda 24 saat önce deneme için bir parça (~ 0.2ml) içeren 2ml tüp içine yerleştirin. Bu tüpler bir alev ısıtılmış insülin iğne kullanılarak yapılan tüp kap içinde bir delik taşımaktadır. </li><li> Tüpler, yüksek hassasiyetli terazi ile sinek yerleştirilmeden önce ve hemen sonra tartılır ve ikincisi ilk değeri çıkarılarak her sinek s ağırlık tanımlamak. Bir tek erkek sinek genellikle 0,7-1 mg ağırlığındadır. </li></ol> Bölüm 2: HRMAS Rotor hazırlanması. <ol><li> Tek bir tüp içinde sinek uyutmak için bir dakika daha az buz koyun. </li><li> Lay, buz üzerine yerleştirilen alüminyum folyo bir katman üzerinde sinek ve sinek sinek yaralanma kaçınarak tam sinek ekleme sağlamak için yumuşak bir fırça kullanarak NMR rotor eklemek semispherical içi boş uzaya hafifçe itin. </li><li> Rotor rotor yerleştirin ve alt (Şekil 1) arasında sinekler bulmak için eklemek zirkonyum oksit (ZrO 2) rotor tüp (4 mm çap, 50 ul) içine yerleştirin. </li><li> Vida ile ekleme kapatın ve sinek ve TSP standart solüsyon (TSP arasındaki temasını önlemek için parafilm (Şekil 1) ile örtün: δ trimethylsilyl propiyonik-2 ,2,3,3-d4 asit, Mw = 172, = 0.00 ppm döteryumlanmış su-D 2 O, rezonans kimyasal kayma ve ölçülmesi için bir referans olarak işlev gördüğü), 50 mM. </li><li> 8 rotor eklemek üstüne TSP standart çözüm ul ekleyin. (Bkz. Şekil 1). </li><li> Güvenli ve bir üst kapağı ile rotorlar kadar bütün sıkın (bkz. Şekil 1). </li></ol> Bölüm 3: Veri Toplama HRMAS <ol><li> HRMAS prob içine rotor tanıtmak ve sihirli açısı 54.7 ° (bkz. Şekil 1) bu pozisyon. </li><li> MAS pnömatik ünitesi ile birlikte bir birim tarafından BTO-2000 4 ° C'de sıcaklığı ayarlayın. Sinekler anestezi korumak için spektrometre 4 ° C süre tutulur. </li><li> 2 kHz MAS HRMAS 1 H MRS iplik hızı ayarlayın. </li><li> MAS hız kontrol ünitesi (Döndürme frekans) 2.0 ± 0.001 kHz MAS dönme frekansı stabilize eder. </li><li> Mıknatıs hazırlanması için: tune ve optimum performans ve kama spektrumları optimum kalite için mıknatıs bobin maç. </li><li> T 2 filtre gibi çalışır] [n-satın alma - (τ τ-180 °) 90 ° Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) spin eko darbe dizisi 2, senkronize rotor kullanarak tek boyutlu 1 H spektrumları kazanmak Tüm numuneler üzerinde tek boyutlu veri elde spektral genişletilmesi 1 H NMR tek sinek spektrumları çıkarın. MAS dönme frekansı (2 kHz) darbeli arası gecikmesi (τ = 500μs) senkronize edin. 32.768 (32k) veri noktaları ile 256 Transientlerin sayısını ayarlayın. Zaman kazancı 9 dk. </li><li> Adyabatik bakliyat 3 TOBSY sırasını kullanarak tüm numuneler üzerinde iki boyutlu (2D) 1 H-1 H HRMAS NMR tek sinek spektrumları edinin. Toplama parametreler şunlardır: 2k veri noktaları doğrudan boyutu (11 ppm spektral genişlik), 1 s gevşeme gecikmesi sırasında su Presatürasyon başına 8 tarama artışla, 128 artışlarla, 2 toplam tekrarlama süresi 45 ms karıştırma süresi ve toplam satın alma 29 dk. </li></ol> Bölüm 4: Veri İşleme / Analiz <ol><li> MRspectra MestReC yazılımı (Mestrelab Araştırma, www.mestrec.com) kullanılarak örneklerin analiz </li><li> 0.5 Hz bir çizgi genişletilmesi apodization fonksiyonu kullanın ve Fourier dönüşümü önce tüm HRMAS 1 H FIDS için geçerlidir. </li><li> Δ = 0.0 ppm (dış standart) TSP ile ilgili MR spektrumları Referans. </li><li> Elle spektrumları Faz ve pik alanı hesaplamaları öncesinde geniş temel bileşenleri çıkarmak için bir Whittaker bazal tahmincisi uygulamak. </li><li> MestReC yazılımı kullanarak pik alanları tahmin. Saygı ile Ölçekli pik yükseklikleri her kökenli spektrumu (TSP tepe yüksekliği = 1) TSP. Gruplar arası oranları grup içinde karşılaştırmak için t-testi (iki uçlu, p &lt;0.05) kullanın. </li><li> 2D TOBSY proses parametreleri: QSINE = iki boyutlu olarak 2 pencere fonksiyonu, 2k doğrudan boyut ve ikinci boyutu, ikinci boyut hem de boyutları ve bazal düzeltme faz düzeltme 1k sıfır dolum noktaları ile FT. </li><li> Sparky programı (TD Goddard ve DG Kneller Sparky 3, USCF, 2D spektrumları üretin <a href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/">http://www.cgl.ucsf.edu/</a>home / Sparky /) </li></ol> Bölüm 5: Live Drosophila melanogaster Temsilcisi Spectra Sinekler Yukarıda açıklanan prosedürleri canlı Drosophila melanogaster sinekler tekrarlanabilir spektrumları toplamak için izin. Wild-tip (wt) Oregon-R edinilen Şekil 2 ve 3 gösteri temsilcisi MR spektrumları uçar. Şekil 2 hediyeler 1D 1 H HRMAS CPMG spektrumları. Baş lipit bileşenleri [C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C Y = C H (5.33 ppm), gliserol (1,3-C H 4.10 ppm ve 4.30 ppm; 2-CH 2 5.24 ppm), küçük ve metabolitleri: β-Alanin (β-Ala 2.57 ppm), asetat (Ac, 1,97 ppm), Phosphocholin (PC, 3.22 ppm) ve phophoetanolamine (PE, 3.23ppm) tespit ve önceki raporlar 4, 5 doğrultusunda tahsis edildi. 2.02 ppm sinyaller mono-doymamış yağ asitleri (yani palmitoleik) C H2-CH = CH benzer parçaları metilen proton ayrıldı. Doymamış asitler 5.33 ppm'de-CH = CH-benzer parçaları protonlar tarafından üretilen bir sinyal tespit edildi. Atanamaz veya 1D spektrum kullanarak görünmez oldular Küçük metabolitleri 2D 1 H-1 H kullanılarak tespit edildi TOBSY HRMAS (bkz. Şekil 3). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Deneysel in vivo kurdu Döteryumlanmış su 14.1 T. Dış standart trimethylsilyl-propiyonik-2 ,2,3,3-d4 asit (TSP / D 2 O) canlı Drosophila soruşturma HRMAS 1H-MRS. HRMAS prob sihirli açıda rotor pozisyonu: kare. <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 canlı Drosophila melanogaster wt sinek in vivo 1D HRMAS 1 H CPMG spektrumları. Lipid bileşenleri: C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58ppm), asetat (Ac), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), (β-Ala) β-Alanin, Phosphocholin (PC) ve phophoetanolamine (PE), Gliserol (1,3-C 2 H 4.10, 4.30 ppm; 2-C H 5.22 ppm) C Y = C H (5.33 ppm). <img src="/files/ftp_upload/1710/1710fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 in vivo 2D 1H-1H 14.1 T. Küçük metabolitleri ve lipid bileşenleri canlı Drosophila melanogaster wt sinek TOBSY HRMAS spektrum tespit edildi. Metabolitlerinin: alanin (Ala), β-Alanin (β-Ala), arjinin (Arg), glutamin (Gln), glutamat (Glu), PC Phosphocholin (PC), phophoetanolamine (PE), Taurin (Tau), α-glikoz (α-YIK) ve gliserol. Lipidler bileşenleri: C H 3 (0.89 ppm), (C H 2) n (1.33 ppm), C H 2 C-CO (1.58 ppm), C H 2 C = C (2.02 ppm), C H 2 C = O (2.24 ppm), C Y = C H (5.33 ppm).

<ol><li>Apidianakis, Y., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+host+for+studying+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection.</a> Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+time%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time.</a> Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).</li>
<li>Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-state+NMR+adiabatic+TOBSY+sequences+provide+enhanced+sensitivity+for+multidimensional+high-resolution+magic-angle-spinning+1H+MR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy.</a> J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).</li>
<li>Astrakas, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+NMR+spectroscopy+shows+lipids+accumulate+in+skeletal+muscle+in+response+to+burn+trauma-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis.</a> Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).</li>
<li>Fan, T. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+by+one-+and+two+dimensional+NMR+analysis+of+complex+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Nuc+Magn+Reson+Spec%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures.</a> Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).</li>
<li>Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution%2C+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+of+Drosophila+at+18.8+Tesla%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla.</a> PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).</li>
<li>Zektzer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+signal+to+noise+in+high-resolution+magic+angle+spinning+total+correlation+spectroscopy+studies+of+prostate+tissues+using+rotor-synchronized+adiabatic+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses.</a> Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).</li>
</ol>

Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvancılık Araştırma İnceleme Kurulu Komitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Son meyve in vivo MRG fizibilite raporu istisna ile 6 uçar, Drosophila in vivo MRS çalışmalarında henüz bildirilmiştir değil. İşbu Protokol, biyolojik olarak önemli moleküller tespit etmek için in vivo HRMAS 1 H-MRS yaklaşımı bir roman uygulanması açıklanmaktadır. Özellikle, biz sıfır sinek ölüm elde ederken, lipidler ve canlı Drosophila küçük metabolitleri yeterli edinimi süresi, yaklaşık 45 dakika, 14.1 T uçar tespit edildi . TOBSY ro...

<table><tbody><tr><td>Döteryum oksit</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetilsilil)propionik-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; asit</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24493-21-8</td><td></td></tr><tr><td>agar, sükroz, maya, mısır unu</td><td>Gıda</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.flystuff.com/&quot;&gt;http://www.flystuff.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Oregon RS veya Canton-S sinekleri</td><td>Yetişkin sinek hatları</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://flystocks.bio.indiana.edu/&quot;&gt;http://flystocks.bio.indiana.edu/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Resim fırçası</td><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td>(boyut 0)</td></tr><tr><td>2 ml'lik tüpler</td><td>Ekipman</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749521-1590</td><td></td></tr><tr><td>Sinek inkübatörleri</td><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td>yüksek nem kapasitesi (%60-75), ayarlanabilir sıcaklık ve 12 sa:12 sa ışık:karanlık döngüsü.</td></tr><tr><td>Bruker Bio-Spin Avance NMR spektrometre (600,13 MHz) 4mm üçlü rezonans (&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H, &lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C, &lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H) HRMAS probu </td><td>Ekipman</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAS pnömatik ünitesi ile kombinlenmiş BTO-2000 ünitesi</td><td>Ekipman</td><td>Bruker Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 mm zirkonyum oksit rotor (kapasite 50 μl)</td><td>Ekipman</td><td>Bruker Corporation</td><td>B3829 (Bruker mağazası)</td><td></td></tr><tr><td>MestReC (Mestrelab Research) </td><td>Yazılım</td><td></td><td></td><td>1D NMR spektrum analizi&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://mestrelab.com/&quot;&gt;http://mestrelab.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>SPARKY 3, USCF</td><td>Yazılım</td><td></td><td></td><td>2B NMR spektrum analizi&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&quot;&gt;http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

canlı manyetik rezonans spektroskopisi drosophila melanogaster magic açısı İplik kullanarak

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Yüksek Çözünürlüklü Magic Açısı İplik (HRMAS) proton manyetik rezonans spektroskopi (<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS), spektral çizgi genişlikleri artırır ve özleri, sağlam hücreler, hücre kültürleri, ve daha da önemlisi sağlam doku elde edilecek yüksek çözünürlüklü spektrumları metabolitleri ve hücresel süreçler arasındaki ilişkileri araştırmak için izin veren bir roman tahribatsız bir tekniktir.<em&gt; In vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS çalışmaları henüz canlı meyve sineği rapor edilecek<em&gt; Drosophila melanogaster.</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt; Basit bir genetik bir organizma olarak, bütün organizma düzeyinde incelenmesi gereken çok sayıda biyolojik fonksiyonları ve çeşitli evrimsel olarak korunmuş sinyal yolakları sağlar ve genetik ve fizyoloji araştırmak için kullanışlı bir modeldir. Bu amaçla, geliştirilen ve uygulanan<em&gt; In vivo</em&gt; HRMAS<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS yöntemi canlı araştırmak için<em&gt; Drosophila</em&gt; Burada 14.1 T., biz bir HRMAS anahat<sup&gt; 1</sup&gt; H-MRS protokolü moleküler karakterizasyonu için<em&gt; Drosophila</em&gt; Bir HRMAS prob ile donatılmış bir konvansiyonel MR spektrometre. Bu teknik, bir roman<em&gt; In vivo</em&gt; Tahribatsız<em&gt; Drosophila</emHastalığı biyobelirteçleri belirlenmesini sağlar ve böylece&gt; metaboliti ölçüm yaklaşımı, terapötik gelişimine katkıda bulunabilir.

Bu teknik, canlı moleküler karakterizasyonu için yüksek çözünürlüklü sihirli açısı proton MR spektroskopi (HRMAS 1H-MRS) iplik kullanımını sağlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Geleneksel 14.1 tesla spektrometre ile bir HRMAS sonda ile donatılmıştır.

Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak

Yüksek Çözünürlüklü Sihirli Açı Döndürmeli (HRMAS) proton manyetik rezonans spektroskopisi (1H-MRS), spektral çözünürlüğü artıran yeni ve tahribatsız bir tekniktir...

Deneyden 24 saat önce, erkek bir sinek iki mililitrelik bir tüpe yerleştirilir. Kısa süreli buz soğukluğunda anestezi uygulandıktan sonra, sinek NMR rotor ekine itilir ve ardından rotor tüpüne yerleştirilir. Rotor ekinin üzerine TSP standart çözeltisi eklenir ve ardından rotorlar bir üst kapakla kapatılır.Rotor, H-R-M-A-S probuna yerleştirilir ve 54.7 derecelik sihirli açıya konumlandırılır. Spektrometre, tek ve iki boyutlu deneylerin gerçekleştirilmesi için ayarlanır. Son olarak, numunelerin Mr.Spectra verileri analiz edilir.Ben Massachusetts General Hospital ve Harvard Tıp Fakültesi Cerrahi Bölümü'ndeki NMR Cerrahi Laboratuvarı'ndan Valeria Rigi. Merhaba, ben Massachusetts General Hospital ve Harvard Tıp Fakültesi Cerrahi Bölümü'ndeki Moleküler Cerrahi Laboratuvarı'ndan Y AB. Merhaba, ben Moleküler Cerrahi Laboratuvarı ve Massachusetts General Hospital ve Harvard Tıp Fakültesi Cerrahi Bölümü direktörü Lawrence Achman.Ben Mario Zika; Massachusetts Journal Hospital'daki NMR Cerrahi Laboratuvarı'nın direktörüyüm ve Harvard Tıp Fakültesi bünyesindeki Aula Martin Merkezi ile bağlantılıyım. Bugün sizlere, tıbbi spin dönme manyetik rezonans spektroskopisi kullanarak büyük Melanogaster'in Moleküler Karakterizasyon Holü için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, yeni terapötik geliştirmelere katkıda bulunan hastalık biyobelirteçlerini tanımlamak amacıyla in vivo Sila metabolitlerini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Haydi başlayalım.Yeni çıkmış sinekleri üç gün boyunca toplayarak hazırlıklara başlayın ve ardından onları taze sinek besini içeren sinek tüplerine aktarın. Toplanan sinekleri, deneyden hemen önce beş ila sekiz günlük olacak şekilde beş gün boyunca inkübe edin. Deneylerimizde sadece erkek sinekler kullanıyoruz.Alevle ısıtılmış bir insülin iğnesi kullanarak tüp kapağına bir delik açıp sinekler için iki mililitrelik deneysel tüpleri hazırlayın. Deneyden 24 saat önce, tekil sinekleri bir parça sinek yemi içeren tüplere yerleştirin. Sinekler yerleştirilmeden hemen önce ve sonra tüpleri tartmak için yüksek hassasiyetli bir terazi kullanın ve iki değer arasındaki farkı çıkararak her bir sineğin ağırlığını belirleyin.Hazırlanan sinekler söz konusu olduğunda, tek bir erkek sinek genellikle yaklaşık 0.7 ile bir miligram ağırlığındadır. Şimdi yüksek çözünürlüklü sihirli açılı dönme veya H-R-M-A-S rotor hazırlama işlemine bakalım. Başlamak için.Tek bir tüpü bir dakikadan daha kısa bir süre buz üzerinde bekletin. İçindeki sineği anesteziye almak için, sineği buz üzerine yerleştirilmiş bir alüminyum folyo tabakasının üzerine koyun ve yumuşak bir fırça kullanarak onu NMR insertinin yarı küresel boşluğuna nazikçe itin. Herhangi bir yaralanmaya yol açmadan sineğin tamamen yerleştirildiğinden emin olun.Sinekleri rotor eki ile rotorun alt kısmı arasında konumlandırmak için eki zirkonyum oksit rotor tüpüne yerleştirin. Ardından, hem rezonans kimyasal kayması hem de nicelleştirme için referans görevi gören TSP standart çözeltisindeki sineklerin herhangi bir temasını önlemek için eki bir vida ile kapatın ve parafilm ile örtün. Rotor ekinin üzerine sekiz µL TSB standart çözeltisi ekleyin ve rotor düzeneğinin tamamını üst kapakla sabitleyip sıkın; şimdi H-R-M-A-S verilerinin nasıl elde edileceğine bakalım.Rotoru H-R-M-A-S probuna yerleştirin ve sihirli açı olan 54,7 dereceye konumlandırın. Ardından, H-R-M-A-S-H tek MRS dönme hızını iki kilohertz MAS olarak ayarlayın ve hızı stabilize etmek için bir MAS hız kontrolörü kullanın. Bir BTO 2000 ünitesi ile sıcaklığı dört derece Celsius'e ayarlayın.MAS pnömatik ünitesi ile birlikte kullanılır. Mıknatısı hazırlamak, bobini optimum performans için ayarlamak ve eşlemek ve optimal spektrum kalitesi için mıknatısı shimlemek amacıyla, sinekler spektromette bulundukları süre boyunca anesteziyi sürdürmek için dört derece Celsius'ta tutulur. Shimleme işlemi tamamlandığında, INTERPULSE gecikmesini MAS rotasyon frekansıyla senkronize edin.Transient sayısını 256, veri noktası sayısını ise 32.768 olarak ayarlayın. Rotorla senkronize bir araç, Purcell MEO kill veya CPMG spin eko puls dizisi kullanarak tek boyutlu tek atışlı spektrum elde edin. Bu dizi, spektral genişlemeyi gidermek için bir T2 filtresi olarak işlev görür.Şimdi, atic darbeleri içeren bir topsy sekansı kullanarak tüm örnekler üzerinde iki boyutlu tek uçuş spektrumu elde edin. Rotoru açın ve uçuşu dışarı çıkarın. Şimdi verilerin nasıl analiz edileceğine bakalım.Numunelerimizin MR Spektrumlarını analiz etmek için mare yazılımını kullanıyoruz. Başlamak için, 0.5 hertz çizgi genişletme fonksiyonunu kullanın ve bunu Fourier dönüşümü öncesinde tüm HRM A SH birlerine uygulayın. MR Spektrumlarını, delta eşittir 0.0 parts per million değerindeki TSP'ye göre referanslandırın.Spektrumu manuel olarak fazlandırın ve pik alanı hesaplamalarından önce baz hattının geniş bileşenlerini çıkarmak için bir Whitaker baz hattı tahmincisi uygulayın. Pik alanlarını mastre yazılımı ile tahmin edin. Elde edilen her spektrum için pik yüksekliklerini TSP'ye göre ölçeklendirin.Şimdi bazı temsili MRS sonuçlarına bakalım; burada, kuyu tipi Oregon R sineklerinden elde edilen temsili bir DH one H-R-M-A-S-C-P-M-G spektrumu gösterilmektedir. Temel lipid bileşenleri olan gliserol ile beta alanin, asetat, fosfokolin ve fosfoetanolamin gibi küçük metabolitler tespit edilmiş ve önceki raporlar doğrultusunda tanımlanmıştır. 2.02 ppm'deki sinyaller, mono-doymamış yağ asitlerinin propan kısmındaki metilen protonlarına atanmıştır. Doymamış asitler, alken kısmının protonları tarafından üretilen 5.33 ppm'deki bir sinyal aracılığıyla tanımlanmıştır.1D spektrumu kullanılarak atanamayan veya görünmeyen küçük metabolitler, iki DH bir H bir top Z-H-R-M-A-S kullanılarak tespit edildi. Böylece, yüksek çözünürlüklü sihirli açı dönmeli (magic angle spinning) manyetik rezonans spektroskopisi kullanarak canlı drosophila'nın biyokimyasal profilinin nasıl inceleneceğini size ilk kez göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, sinekleri yaralamadan yerleştirmek için yumuşak bir uç kullanmak önemlidir.Böceğin gövdesine zarar vermemek için vidaları çok fazla sıkmadığınızdan emin olun ve sinekler hayatta kalamayabileceği için bir saatten fazla süre boyunca spektrum almayın. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneyinizde başarılar dileriz.

magnetic-resonance-spectroscopy-live-drosophila-melanogaster-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bu protokol, elektron spin rezonans mikroskobu ile canlı hücreler hemen ortamda oksijen konsantrasyonu mikron ölçekli üç boyutlu görüntüleme için bir yöntem açıklanır.

Elektron Spin Rezonans Oksijen Haritalama için Canlı Türlerinin Micro-görüntüleme

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Bu iletişim kuralı maliyet-etkin ve uygun farmakolojik ajanları, sinirsel proteinlerin genetik mutasyonlar test etkinleştirmek için Drosophila melanogaster merkezi sinir sistemi azalan elektriksel aktivitesinin kaydetmek için bir yöntem açıklar, ve/veya keşfedilmemiş fizyolojik yolları rolü.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

Katıların, sıvıların, gazların ve karışımların moleküler yapıları ve dinamikleri çeşitli bilimsel alanlar için kritik öneme sahiptir. Yüksek sıcaklık, yüksek basınçlı yerinde MAS NMR, sıkı kontrol edilen kimyasal ortamlarda karışık fazlı sistemlerde bileşenlerin kimyasal ortamının tespitini sağlar.

Yüksek Sıcaklık ve Yüksek Basınç Yerinde Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), genetiği değiştirilmiş farelerde fenotip incelenmesi için giderek daha popüler bir araç haline gelmiştir. Bu makale, çoklu-fare MRI kullanarak genetiği değiştirilmiş farelerde yüksek verimli fenotipleme ulaşmak için gerekli yöntemleri göstermektedir.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

Genetik olarak kodlanmış optogenetic araçları belirli nöronların noninvaziv düzenlenmesini...

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Öğrenin canlı Drosophila melanogaster'in moleküler karakterizasyonu için yüksek çözünürlüklü manyetik açılı dönüşlü proton MR spektroskopisi (HRMAS 1H-MRS) yöntemini. Bu teknik metabolik süreçleri incelemek için değerlidir.

Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak

Daha fazla video keşfet