Name: Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-08T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Öğrenin, Bacillus subtilis hücrelerinde DNA tamir komplekslerinin gerçek zamanlı oluşumunu GFP füzyon proteinleriyle görüntüleme yöntemini. Bu protokol canlı hücrelerde uyumsuzluk tamir dinamiklerini incelemek için güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr teşekkür etmek istiyorum. Başlangıçta floresan mikroskopi LAS eğitim için Philina S. Lee ve Alan D. Grossman. Yazarlar ayrıca teşekkür Dr. Yardım ve ipuçları görüntüleme için Melanie Berkmen ve Hajime Kobayashi. Bu çalışma, Edebiyat, Fen-Edebiyat Fakültesi ve Michigan Üniversitesi, Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü start-up fonları tarafından desteklenen oldu.

Mikroskopi için hücrelerin Büyüyen kültürlerin 1. Bir veya iki gün önce görüntüleme, B. hazırlamak subtilis görselleştirmek için istediğiniz translasyonel füzyon proteini içeren süzün. Adımları 1A ve 1B Deneme turlarında, büyüme durumu suşu en iyi görüntüyü sağlayan belirlemek için gerekli olacaktır. Çoğu durumda, hücreler, üstel büyüme aşamasında görüntülü olmalıdır. <ol class="ualpha"><li> Bazı B. subtilis suşları (endojen lokustaki ilgi ve GFP geninin arasında translasyonel füzyon entegrasyonu nedeniyle yetersiz büyümeye, özellikle suşları), görüntüleme için iki gün önce ilk büyüme, yüksek kaliteli görüntüler için gerekli . Ilk gününde, çizgi B. subtilis seçici antibiyotik (ler) ile LB agar yansıması zorlanma ve 30 ° C'de bir gece inkübe Ikinci gününde, tek bir koloni ile 100 ul 0.85% serum fizyolojik aşılamak ve 30 gece inkübasyon tarafından her seyreltme 100 mcL kaplama LB agar plakaları üç 10 kat seri dilüsyonları (seçici antibiyotikler ile), ° C gerçekleştirmek Üçüncü gününde, hücrelerin ışık konfluent büyüme ile seyreltme plaka seçin. Bir tabak Işık konfluent büyüme potansiyel (adım 4) mükemmel görüntüleme sonuçlar, katlanarak büyüyen sağlıklı bir başlangıç ​​inokulum ile büyüme ortamı sağlayacaktır. Bu adım, leke FM4-64 ile en yüksek kaliteli membran görüntüleme için yararlıdır. </li><li> B. Diğer subtilis suşları sadece steril bir çubuk görüntüleme için önceki gün ile tek koloniler için seçici LB agar uygulanacak ve 30 ° C'de bir gece inkübe Ertesi gün, bu plaka üzerinde hücreler (adım 4) görüntüleme için bir inokulum olarak kullanmak yeterli olacaktır. NOT: B. subtilis, sıvı bir ortamda geceleme kültürleri 1 lag fazı büyüme bir süre neden spor oluşumu ve yeter tepkiler, bir kombinasyonu nedeniyle uygun değildir. </li></ol> 2. Görüntüleme, yerine 10 ml, 125 ml steril Erlenmeyer şişesinin içine S7 50 1-3 orta sabahı . 3. Inokulum elde etmek için tek koloniler veya ışık konfluent hücreleri LB agar plaka S7 50 orta 2 ml kadar hücrelerin yeniden süspanse edin. 4. ~ 0.08 0.1 ila 600 nm dalga boyunda ölçülen bir ilk optik yoğunluk (OD 600) ile 10 ml S7 50 orta bir kültür içeren Erlenmeyer şişesi yeterli S7 50 orta hücre inokulum ekleyin. Bu aşamada, en az 10 kat hava orta oranı olması önemlidir. Böylece, 10 - 12.5 ml 125 ml Erlenmeyer şişesinin inoküle orta kullanın. 5. Kültür OD 600 ~ ulaşır 0.5-0.8 ° C ye kadar her 30 kültür büyütün. Çalkalamalı su banyosu, 150-200 dakikada devrimlerle tercih edilmektedir. DNA'nın zarar veya uyumsuzluğu indükleyici ajanlar ile meydan Kültürler erken bir üstel büyüme aşamasında olmalıdır OD 600 hücrelerin (bkz. Tablo 1), tedavi için gerekli olan büyüme ek süre ile OD 600 hedefe ulaşmak olacağını , Örneğin, 2-aminopurine bir tedavi saat, 2 aminopurine ile tedavi edilen bir kültür ve bu nedenle tedavi bir OD 600 / büyüme sonuçlar bir saat ~ 0.5-0.8 gibi, OD 600 ~ 0.3-0.4 olmalıdır gerektirir. sayede hücreleri görüntüleme için hazır. Numune Hazırlama 1. Pipet, 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kültür hücreleri 300 ul. 2. Hücre zarının görüntüleme isteniyorsa, 1 mg / ml stok solüsyonu leke FM4-64 membran (Invitrogen) her numune için 1:1000 dilüsyon ekleyin. FM4-64 A titrasyon istenen floresan sinyal elde etmek için gerekli olabilir. Tipik bir titrasyon aralığı, 1:100, 1:1000 ve 1:10,000. 3. Örnekleri, aşağıda açıklandığı gibi slayt 1X Spizizens orta% 1 agaroz ile hazırlanmakta olan ise, on dakika kadar veya oda sıcaklığında oturmak (bkz: adım 1 "slayt hazırlama") izin verin. 4. Hücre konsantrasyonu gerekiyorsa, biz, bir vakum cihazı ile filtre 0.2 mikron kullanarak filtreleme hücreleri tercih ediyor. Hücreler daha sonra PBS, uygun başka bir tampon veya görselleştirme önce orta filtre yüzeyinden nazikçe yıkanabilir. Slayt hazırlanması 1. 1X Spizizens% 1 agaroz hazırlayın. 5 ile 0.5 g agaroz ile birlikte 10X Spizizens stok ml 45 ml ddH2O ve eritmek için mikrodalga ekleyin. Sıcak erimiş agaroz pipetle zor ve agaroz pipet girmez pekiştirdi. Agaroz ° C pipet girmek için içinde katılaşabilme olmadan, bir sıcaklık 55-65 ~, bir su banyosu içinde dengelenmiş olmalıdır ucu. 2. % 1 erimiş agaroz Spizizens 20 ul pipet içine çizin. Agaroz çözüm sığ agaroz pedleri oluşturmak için her slayt (15 iyi slaytlar, bkz. Tablo 2) tek bir damla (yaklaşık 1-2 mcL) Pipet. Agaroz hemen pekiştireceğiz. Slaytlar da hücrelerin uygulamaya hemen önce yapılmalıdır. Agaroz pedleri sadece oda sıcaklığında bırakılırsa, onlar birkaç dakika içinde kurutmak ve kullanılamaz hale gelebilir. Agaroz pedleri merkezli ve her doldurmak iyi ama lamel bozmamak için en az yüksekliğe sahip olmalıdır; damlacıkları (baloncuk) gibi çok yüksek ya da örnek de sınır ötesine yayılır, sadece tokatlamak bir Kimwipe iyi temiz ve uygulamak Yeni agaroz ped. 3. Her agaroz pad üstüne dağıtılan slayt, tüm 300 ul örneği (bkz. adım 6) uygulayın. Bu hücre miktarı slaytta her iyi karşılamak için yeterli olmalıdır. 4. Yaklaşık on dakika boyunca oda sıcaklığında (23 ° C) oturup hücreleri yüklü slayt izin verin. Bu adım, agaroz ped hareketsiz görüntüleme için ve hazır olma niyet hücreler için izin verecektir. Bir sıcaklık değişimi 4 gerektiren deneyler yaparken, özel ihtiyaçları için bu sıcaklık, örneğin, değiştirilmesi gerekebilir . 5. Pedleri kendileri çıkarmadan her kuyudan fazla orta aspire edin. 6. Slayt alanı boyunca, yavaşça ve eşit sıkıca basarak, ancak, slayt lamel uygulayın. Kapak kayma, slayt karşı ve kapak kayma slayt üzerinde yükseltilmiş değildir olduğundan emin olmak için kontrol edin. Hücre Görselleştirme 1. Birçok farklı floresans mikroskopları iyi çalışacaktır. 100X immersiyon yağı lens için kritik öneme sahiptir. Simmons Lab kullanır: <ul><li> Olympus BX61 mikroskop 1,45 NA TIRFM 100X immersiyon yağı objektif lens ile donatılmış </li><li> Hamamatsu ORCAR 2 CCD kamera soğutmalı </li><li> Lümen 200 ark metal (Önceki) ışık kaynağı. </li><li> GFP (FITC), filtre uyarma 460-500 ve 510-560 emisyon tespiti için </li><li> FM4-64 (TRITC), filtre, uyarma 510-560 ve emisyon 572-648 tespiti için. </li><li> Görüntüler SlideBook 4.2 (Şekil 1) kullanarak ele geçirildi </li></ul> 2. Hücreleri, beyaz ışık kullanarak odak noktası haline getirin. 3. Her fluorofor için uygun filtreleri kullanarak görüntü yakalayın. Temsilcisi Sonuçlar Temsilcisi görüntüleri (Şekil 1). FM4-64 boyama 4-7 parlak ve net olmalıdır GFP odakları, iyi tanımlanmış olmalıdır. GFP veya membran görüntüleri herhangi bir veri kaybı olmadan sunulacak en yüksek kalitede görüntü için izin vermek için herhangi bir renk ile sözde renkli olabilir. <img src="/files/ftp_upload/1736/1736fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: B. Temsilcisi GFP görüntüleri FM4-64 membran boyanması kırmızı ile gösterilen ise subtilis translasyonel füzyon proteinleri GFP proteinler, yeşil gösterilmiştir. Beyaz ölçek çubuğu 3 mikron gösterir (A) bisiklet, GFP ilgili genotip: bisiklet, GFP (spc), amyE: Pspac mutL (kedi)] 600 mg / ml 2-aminopurine ve 1 mM IPTG varlığı. FM4-64 sinyal bisiklet, GFP odakları daha net bir şekilde göstermek amacıyla sunulan değildir (B) MutL GFP [ilgili genotip: mutL: mutL-GFP (spc)]. 2-aminopurine varlığı (C) DnaX-GFP [ilgili genotip: dnaX: dnaX-GFP (spc)]. (D) reca-GFP ilgili genotip: Reca: reca-GFP (spc)] varlığı 20 ng / ml mitomisin C (E) TagC-GFP [ilgili genotip: tagC: tagC-GFP (spc) 1 mcg / ml mitomisin C varlığı] <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Tedavi / konsantrasyon veya miktarı </td><td> Fonksiyon </td><td> Inkübasyon süresi </td></tr><tr><td> Mitomisin C (MMC) [20 - 150 ng / ml] </td><td> DNA ajan alkilleyici </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> 2-aminopurine (2-AP) [600 mg / ml] </td><td> uyumsuzluğu indükleyici </td><td> 1 saat </td></tr><tr><td> Hidroksiüre (HU) </td><td> dNTP tüketir </td><td> 3 saat </td></tr><tr><td> ultraviyole ışınları (UV) 20 J/m2 </td><td> Timin-timin dimerleri ve 6-4 photoproducts </td><td> 20 saniye, genellikle kaynağına bağlı olarak değişir. </td></tr><tr><td> griler (iyonizan radyasyon) 5 100 Gy </td><td> Çift iplikli sonları, tek zincirinde kırılmalara ve baz hasarı siteleri </td><td> kaynağına bağlı olarak değişir. </td></tr></tbody></table>"DNA&gt; Tablo 1 Özet zarar ve uyumsuzluğu indükleyici tedavileri <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Multi slayt, 15-iyi </td><td> MP Biyomedikal </td><td> 6041505E </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Kapak Camlar </td><td> Balıkçı </td><td> 12-544-B </td><td></td></tr><tr><td> Agaroz </td><td> Balıkçı </td><td> BP160-500 </td><td></td></tr><tr><td> Mitomisin C </td><td> Sigma </td><td> M0503-2MG </td><td> mutagen, eldiven </td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> Sigma </td><td> A3509-250mg </td><td> eldiven </td></tr><tr><td> Hidroksiüre </td><td> Sigma </td><td> H8627-25G </td><td> eldiven </td></tr><tr><td> FM4-64 </td><td> Invitrogen </td><td> T13320 </td><td> ışığa karşı hassastır </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Özel reaktifler ve ekipman listesi:

<ol><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).</li>
<li>Berkmen, M. B., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+organization+of+the+Bacillus+subtilis+replication+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle.</a> Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clp+and+Lon+proteases+occupy+distinct+subcellular+positions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+is+required+for+the+RecA+localization+response+to+DNA+damage+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).</li>
<li>Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((b+Clamp+Directs+Localization+of+Mismatch+Repair+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis.</a> Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).</li>
<li>Simmons, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+responses+to+double-strand+breaks+between+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+reveals+different+requirements+for+SOS+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction.</a> J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).</li>
<li>Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mismatch+repair+in+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of mismatch repair in bacterial cells.</a> Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).</li>
</ol>

Deneme ve yanılma her suşu için yüksek kaliteli görüntüler için maruz kalma koşullarını bulmak için gereklidir; 100 2000 ms pozlama GFP (FITC) ve FM4-64 için uygun iken, 1 milisaniye beyaz ışık görüntüler için uygun olduğunu bulmak (TRITC ) görüntüleri. Pozlama süresi kullanılan görüntüleme cihazları bağlı olarak değişecektir. Biz, aynı slaytta birden fazla suşları mevcuttur ped ped sınır hücrelerinin kalite ve difüzyon gerginlik farklılaşma karmaşık hale getirebilir basit görüntüleme için 15 kuyu mikroskop lamı başına ...

Özel çözüm tarifleri: 1 10x S7 50 tuzları 0,5 M MOPS 100 mM Amonyum Sülfat 50 mM potasyum fosfat mono Sterilize Filtresi ve depolama önce sarın S7 folyo ile 50 medya 100x Metaller 0.2 M MgCl 2 70 mM CaCl 2 5 mM MnCl 2 0.1 mM ZnCl 2 100 mcg / mL Tiamin HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl 3 * dH 2 O son hacim * FeCl 3 yağış önlemek için, son ilave edilmelidir. Filtre Sterilizasyon sonrasında, folyo sarın 100x Metal çözüm. S7 50 medya 1x S7 50 tuzları 1x Metal 1% Glikoz 0.1% Glutamat 40 mcg / ml Triptofan 40 mcg / ml Fenilalanin H 2 O son hacim distile 10x Spizizens (gram / ​​L) 151.4 mM Amonyum Sülfat (20g / L) 803,8 mM potasyum fosfat mono (140g / L) 440,9 mM potasyum fosfat dibazik (60g / L) 34,0 mM Sodyum Sitrat (10g / L) 16.6 mM MgSO 4 (2 g / L) dH 2 O son hacim Sterilize filtreleme

görüntüleme uyuşmazlığı dna hasar onarım ve hücresel yanıtları bacillus subtilis</em

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Hem prokaryot ve ökaryotlarda DNA hasarı karmaşık bir dizi fizyolojik değişiklikler ile yanıt verir. Gen ekspresyonu, mevcut proteinlerin yeniden dağıtımı ve yeni protein kompleksleri montaj değişiklikler DNA lezyonları ve eşleşmeyen DNA baz çifti çeşitli teşvik edilebilir. Floresan mikroskopi DNA lezyonları ve karmaşık hücre içi mimari canlı bir hücre içinde DNA replikasyon durumunu izlemek için bu ve diğer tepkiler görselleştirilmesi ve ölçülmesi için güçlü bir deney aracı olarak kullanılmıştır. , Floresan muhabiri proteinleri ve DNA replikasyonu ve tamiri makine bileşenleri arasında Translasyonel füzyonlar ipuçlarını belirlemek için kullanılan hedef DNA onarım proteinleri cognate lezyonlar<em&gt; In vivo</em&gt; Ve bu proteinlerin bakteri hücrelerinin içinde nasıl organize edilir, anlamak için. Buna ek olarak, DNA hasarı indüklenebilir sahiplerine bağlanan transkripsiyonel ve translasyonel füzyonlar nüfus içinde hücre genotoksik stres yanıtları aktif olduğunuz ortaya koymuştur. Bu derlemede, floresan mikroskobu kullanarak görüntü, DNA onarım ve tek bir bakteri hücrelerinin DNA replikasyonu kompleksleri montaj için detaylı bir protokol sağlar. Özellikle, bu çalışmanın görüntüleme uyumsuzluğu onarım proteinler, homolog rekombinasyon, DNA replikasyonu ve SOS-indüklenebilir bir protein üzerinde duruluyor<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt;. Burada açıklanan tüm prosedürler bakteri türlerinin çeşitli görüntüleme protein kompleksleri kolayca mükellef bulunmaktadır.

Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu açıklanmıştır<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Hücreler.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Hem prokaryotlar hem de ökaryotlar, karmaşık bir fizyolojik değişimler seti aracılığıyla DNA hasarına yanıt verirler. Gen ekspresyonundaki değişiklikler, yeniden dağılım...

Hatalı eşleşme onarımı proteinlerinin translasyonel füzyonlarını taşıyan Baus TLU suşları. GFP ile füzyonlanmış proteinler seçici besiyerine ekilir. İzole edilen hücreler, sıvı kültüre taze inokülüm olarak kullanılır.Hücreler, OD 600 değeri 0,3 ile 0,4 arasına ulaşana kadar büyütülür; bu noktada istenirse uyumsuzluk indükleyici işlemler uygulanır ve hücreler OD 600 değeri 0,5 ile 0,8 arasına ulaşana kadar büyütülmeye devam edilerek toplanır. İstenirse membran boyası FM 4 64 eklenir ve hücreler, hazırlanmış agar pedleri bulunan lamlara uygulanır; fazla besiyeri aspirasyon yoluyla uzaklaştırıldıktan sonra hücrelerin çökmesi beklenir.Bir lamel kapatılır ve hücreler mikroskopi ile görüntülenir. Merhaba, ben Michigan Üniversitesi Ann Arbor, Moleküler, Hücresel ve Gelişimsel Biyoloji Bölümü'nde Dr. Lyle Simmons'ın laboratuvarından Dr. Andrew Kow. Bugün size, bacillus solus'ta DNA uyumsuzluk onarım proteinlerinin yanı sıra diğer onarım ve ribozomal proteinlerin translasyonel füzyonlarını görüntülemek için kullanılan bir prosedürü göstereceğiz.Bu prosedürü, Bacillus subtilis canlı hücrelerindeki DNA uyumsuzluk onarım proteinleri ile ribozomal proteinler arasındaki etkileşimi incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, bazı suşlar için görselleştirmek istediğiniz translasyonel füzyon proteinini içeren B subtilis suşlarını hazırlayın.Görüntülemeden bir gün önce başlanması yeterlidir. Bunlara örnek olarak, GFP ile ilgilenilen gen arasındaki translasyonel füzyon genin endojen lokusuna yerleştirildiğinde iyi büyüyen MU LGFP gibi suşlar verilebilir. Görüntülemeden bir gün önce başlandığında, bakterileri plakalardaki seçici LB agro besiyerine uygulamak için steril koşullar altında steril bir çubuk kullanın.Tekil kolonilerin üretilmesi için 30 °C'de gece boyunca inkübe edin; ertesi gün koloniler başlangıç inokulumu olarak kullanılacaktır. Bazı B sublist suşlarının, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek amacıyla mikroskopi öncesinde iki günlük büyümeye ihtiyacı vardır. İki günlük büyümeye ihtiyaç duyan spesifik suşlar, rec A GFP gibi translasyonel füzyon nedeniyle ilk gün kötü büyüyenlerdir; bakterileri selektif LB AED üzerine ekip gece boyunca inkübe edin.İkinci günde, seri dilüsyon gerçekleştirin. Öncelikle, 100 µL %0,85'lik salin ile inoküle etmek için tek bir koloni seçin, ardından dört kez on katlı seri dilüsyon yapın; her bir salin dilüsyonunun yanı sıra başlangıç kolonisi ve salini, selektif antibiyotikler içeren LB agar plaklarına 100 µL şeklinde ekleyin ve plakları genellikle 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. İkinci gece inkübasyonundan sonra, hücrelerin hafif konfluent büyüme gösterdiği dilüsyon plağını seçin.Bunlar, potansiyel olarak mükemmel görüntüleme sonuçları veren, sağlıklı ve eksponansiyel olarak büyüyen bir başlangıç inokülumu sağlar. Bu durum, özellikle membran boyamanın en yüksek kalitede görüntülenmesi için oldukça faydalıdır. Görüntüleme sabahı FM 4 64 ile birlikte, 125 mL'lik steril bir erlene 10 mL S seven 50 besiyeri ekleyin.Böylece hava-besiyeri oranı en az on kat olarak korunur. Bir inokülüm elde etmek için hücreleri, lppl'den tek koloniler veya benzer konfluens düzeyindeki hücreler ile maksimum iki mililitre S seven 50 besiyeri içerisinde resüspande edin. 10 mililitre S seven 50 besiyeri içeren Erlenmeyer flaskına, kültürün başlangıç OD 600 değeri yaklaşık 0,08 ila 0,1 olacak şekilde yeterli miktarda S seven 50 besiyeri hücre inokülümü ekleyin.Ardından, her kültürü görüntülenecek B alt liste suşu için uygun sıcaklıkta büyütün. Dakikadaki devir sayısı 150 ile 200 arasında olan çalkalamalı su banyoları tercih edilir. Kültürleri, OD 600 değerleri yaklaşık 0,5 ile 0,8'e ulaşana kadar büyütmeye devam edin.DNA hasarına yol açan veya yanlış eşleşmeyi tetikleyen ajanlarla işlem gören kültürler için, DNA değiştirici ajanla inkübasyon süresinin sonunun, hedef OD 600 değerine ulaşılan zamanla örtüşecek şekilde planlama yapın. Örneğin, genoma entegre edildiğinde yanlış eşleşmiş bir bazı taklit eden bir DNA tabanlı analog olan 2-aminopürin, bir saatlik inkübasyon gerektirir ve mutLGFP gibi yanlış eşleşme onarım proteinlerinin odak oluşturmasına yol açar. Bununla birlikte, RecA GFP odak oluşumu, çift zincirli DNA kırılmalarının indüklenmesi için mitomisin C veya başka bir DNA hasarı reaktifi ile bir saatlik inkübasyon gerektirir; hem 2-aminopürin hem de mitomisin C eklenir.Kültürler yaklaşık 0.3 ila 0.4 OD 600 değerine ulaştığında ve her iki işlemle de gerekli olan bir saatlik büyüme süresinin ardından, kültürler büyük olasılıkla 0.5 ila 0.8 OD 600 değerine ulaşmış olacak ve görüntüleme için hazır hale gelecektir. İşleme, 300 µL kültürlenmiş hücreyi 1.5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyerek başlayın. Hücre membranlarının, her numuneye mililitrede bir miligram FM 4 64 membran boyasının 1:1000 dilüsyonu ile görüntülenmesi isteniyorsa, istenen floresan sinyalini elde etmek için FM 4 64 titrasyonu gerekebilir.Tipik bir titrasyon aralığı 1'den 100'e veya 1'den 10.000'e kadardır. Örneklerin 10 dakikaya kadar veya lam hazırlanırken bekletilmesine izin verin. Hücre konsantrasyonunun belirlenmesi gerekiyorsa, hücreleri vakum düzeneği ile 0,2 µm filtre kullanarak süzün.Ardından, hücre örnekleri inkübe edilirken hücreleri uygun tampon veya besiyeri ile filtreden nazikçe yıkayarak uzaklaştırın. FM 4 64 ile. 5 ml 10x zens stok çözeltisini 45 ml distile suya 0,5 g agros ile ekleyip eritmek için mikrodalga fırında ısıtarak 1% agros'u bir x zens ile hazırlayın.Agarozun sıcaklığının bir su banyosunda yaklaşık 65 °C'ye dengelenmesini bekleyin ve %1'lik eritilmiş agarozdan 20 µL'yi bir pipet ucuna çekin. Çok sıcak olan agarozu pipetlemek zordur; soğuk agaroz ise katılaşarak pipet ucuna girmeyecektir.Ardından, multitest 15 kuyucuklu bir lam kullanın ve her bir lam kuyucuğuna yaklaşık bir ila iki mikrolitre aros çözeltisinden tek bir damla pipetleyin. Sığ aros pedleri oluşturmak için aros hemen katılaşacaktır.Dehidrasyonu önlemek ve lamların kullanılamaz hale gelmesini engellemek için lamlar, hücrelerin uygulanmasından hemen önce hazırlanır. Aros pedler merkezlenmeli ve her kuyucuğu doldurmalı, ancak lamelin yerinden oynamasını önlemek için minimum yükseklikte olmalıdır. Damlacıklar çok yüksekse veya kabarcık şeklindeyse ya da örnek kuyucuk sınırlarının dışına yayılırsa, kuyucuğu bir kim wipe ile temizleyip yeni bir aros ped uygulayın.Lam hazırlandıktan sonra, daha önce mikro santrifüj tüpünde ayrılan 300 microliter örneğin tamamını, her bir aeros pedinin üzerine dağıtacak şekilde lama uygulayın. Bu hücre miktarı, lam üzerindeki her bir kuyucuğu kaplamak için yeterli olmalıdır. Hücrelerin yüklendiği lamı oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika bekletin.Bu adım, hücrelerin agros ped üzerine çökmesini ve hareketsiz hale gelmesini sağlayarak 10 dakikalık inkübasyonun sonunda görüntüleme için hazır olmalarına imkan tanır. Pedleri yerinden çıkarmadan her kuyucuktaki fazla besiyerini aspire edin. Lamelini, lam üzerindeki alana sıkıca, eşit ancak nazikçe bastırarak uygulayın; lamelin lama tam temas ettiğinden ve lamın üzerinde yükselmediğinden emin olmak için kontrol edin.Görüntüleme aşamasına geçmek için birçok farklı floresan mikroskobu iyi sonuç verecektir. 100 x yağ daldırma objektife sahip olmak kritiktir. Simmons laboratuvarı; toplam iç yansıma, floresan mikroskobu veya turf m için uygun, 1.45 sayısal açıklıklı 100 x yağ daldırma objektif lensle donatılmış bir Olympus BX 61 mikroskobu kullanmaktadır.Mikroskop ayrıca CCD soğutmalı bir kamera ve LU 200 ark metal ışık kaynağı ile donatılmıştır. Beyaz ışık kullanarak hücreleri odaklayarak başlayın. Her flora için uygun filtreyi kullanın.GFP tespiti için dört. FM 4 64 tespiti için 60'tan 500'e uyarıcı ve 510'dan 560'a emisyon filtresini kullanın. 510'dan 560'a uyarıcı ve 572'den 648'e emisyon filtresini kullanın.Her kat için uygun filtreleri kullanarak görüntüyü yakalayın. Slayt kitabı 4.2 yazılımı ile dört adet çekim yapın. Aşağıda, GFP'ye translasyonel olarak füzyonlanmış DNA uyumsuzluk onarım proteini MU L'nin görüntülemesine ait bazı temsili sonuçlar yer almaktadır.MU LGFP'nin işlem görmemiş kontrol kültürü, hücrelerin çoğunun yalnızca sitoplazmik düzeyde mut LGFP füzyon proteini içerdiği minimal odakların oluştuğunu göstermektedir. Ancak, genomuna entegre edildiğinde hatalı eşleşmiş bir bazı taklit eden 2-aminopürin varlığında büyütülen hücrelerin çoğunda, mutal GFP proteininin hatalı eşleşmiş DNA bazlarının tanınması ve onarılmasında yer aldığını gösteren GFP odakları bulunmaktadır.DNA hasarını indükleyen mitomisin C varlığında büyütülen REC A GFP suşu ile benzer sonuçlar elde edilir. Burada, mitomisin C uygulaması sonrası hücrelerin çoğunluğu bir rec A GFP odağı içerir; bu durum rec A GFP'nin DNA hasarına yanıt vererek onarım sürecini başlattığını gösterirken, mitomisin C uygulaması olmadan pho IR görülmez. Canlı Bacillus subtilis hücrelerinde onarım proteinlerinin nasıl görselleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken.Acele etmemeniz, hücreleri uygun şekilde odaklamanız gerektiği ve bunun aslında biraz pratik gerektirebileceği unutulmamalıdır. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

imaging-mismatch-repair-cellular-responses-to-dna-damage-bacillus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz, iki boyutlu agaroz-jel analizi, UV ışını meydana çoğaltma ara yapısını tanımlamak için kullanılır olabilir bir prosedür sunuyoruz.

UV ile indüklenen Çoğaltma Ara Görselleştirme E. coli İki boyutlu agaroz-jel Analizi

Elektron spektroskopik görüntüleme, nükleik asidi proteinden nanometre çözünürlükte görüntüleyebilir ve ayırt edebilir. Transmisyon elektron mikroskobu örneklerinde etiketli proteinleri özel olarak etiketleyebilen miniSOG sistemi ile birleştirilebilir. Örnek olarak çift iplikli kopma onarım odaklarını kullanarak bu teknolojilerin kullanımını gösteriyoruz.

Elektron Spektroskopik Görüntüleme Kombinasyonunun miniSOG Etiketli DNA Onarım Proteinler Görselleştirme (ESI)

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

DNA hasar inducing ve DNA onarım proteinler seçili alt nükleer alanlarda yanıt izlemek confocal floresan mikroskopi ve lazer mikro-ışınlama teklif araçları. Bu teknik, hasar tespiti, sinyal ve işe alım ile ilgili bilgilerimizi önemli ölçüde ilerlemiştir. Bu el yazması tek ve Çift Kişilik strand sonu onarım incelemek için bu teknolojilerin gösterir.

Lazer mikro-ile kullanma için tek incelenmesi ve çift Strand Break onarım memeli hücrelerinde

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu makalede immünostaining ve kromatin immünödeksiasyonunun temel adımları tanıtılmaktadır. Bu protokoller genellikle DNA hasarına bağlı hücresel süreçleri incelemek ve DNA onarımına karışan proteinlerin alımını görselleştirmek ve ölçmek için kullanılır.

Endononülaz Bazlı Meydana Özgü DNA Hasarlarını Görselleştirme ve Ölçme

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Rasyometrik bimoleküler işaretleri (RBMBs) canlı hücreler görüntü tek bir mühendislik RNA transkriptleri için kullanılabilir. Burada, RBMBs, mikroporasyonu ve gerçek zamanlı olarak tek RNA transkriptlerinin floresan görüntüleme hücrelere RBMBs teslimat hazırlanmasını ve saflaştırılmasını tanımlarlar.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Öğrenin, Bacillus subtilis hücrelerinde DNA tamir komplekslerinin gerçek zamanlı oluşumunu GFP füzyon proteinleriyle görüntüleme yöntemini. Bu protokol canlı hücrelerde uyumsuzluk tamir dinamiklerini incelemek için güvenilir bir çerçeve sunar.

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis

Daha fazla video keşfet