Name: Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Öğrenin, civciv embriyonik omurilikte genetik olarak tanımlanmış nöronların aksonal yollarını in ovo elektroporasyon ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik nöral devre gelişimini araştırmak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı, İsrail sağlık bakanlığı, ve DFG (Alman Araştırma Vakfı) AK hibe tarafından desteklenen oldu.

I. Elektroporasyon Yumurta taşıma <ol><li> Nemlendirilmiş bir inkübatör seti 37-38 ° C, tercih sallanan tepsileri bir kuluçka yumurtaları yerleştirin. </li><li> Hamburger ve Hamilton (HH) evre 18-20 ulaştığınızda Embriyo, kuluçka yaklaşık 66 saat sonra electroporated. Bu aşamada, baş, gövde (servikal eğme olarak adlandırılan durum) ve ön, arka, sağ ve sol vitellin venlerin görülmesi gereken ekstra embriyonik kan damarları, geniş bir dizi doğru açılarda yatıyor. Bu arttırıcı bağımlı spesifik ifade 1,3,4 için optimal bir aşamasıdır. Uygulanabilir ve senkronize embriyolar elde etmek için, inkübatör sıcaklık ve nem izlemek için önemlidir. </li><li> Inkübasyon 66 saat sonra, yumurtalar inkübatör çıkarın. Yumurta yatay olarak yerleştirin. 5-10 dakika bekleyin. Embriyo artık yumurta üst kutbunda yer almaktadır. </li></ol> Hazırlıklar <ol><li> Hank çözümü penisilin / streptomisin (P / S) (1:100 dilüsyon) ile hazırlayın. </li><li> Microcapillary cam kılcal damarlar (0.5 mm çap) çekin. </li><li> Mikromanipülatör içine elektrotlar (tungsten) yerleştirin ve darbe jeneratörü (ECM 830) elektrotlar bağlamak. </li><li> - 3, darbe uzunluğu 50 ms voltaj 30v, bakliyat sayısı: Aşağıdaki parametreler ile darbe jeneratörü ayarlayın. </li><li> Ağız pipet, bir şırınga iğnesi ve bir kaset hazırlayın. </li><li> DNA (2-5μg/μl) istenen bir karışım hazırlayın ve Hızlı Yeşil boya ekleyin. </li></ol> Pencereleme ve elektroporasyon <ol><li> Bir şırınga kullanarak, her bir yumurta 5-6 ml albümin çıkarın. </li><li> Yumurtanın üst tarafında küçük bir makas bir oval pencere açıkken. </li><li> 0.5-1ml Hank + P / S çözümü ile Nemli embriyo. </li><li> Cam DNA karışımı ile microcapillary yüklemek için, bir ağız pipet kullanın. </li><li> Size doğru kuyruk ile embriyo yerleştirin. Bu aşamada, embriyo omurilik açıkça görülür. Bu nedenle, hiçbir karşıt teknikler gereklidir. Omurilik iki ucunda, baş ve kuyruk mühürlenmiş, ancak sizin microcapillary yeterince ince ise, küçük bir delik ponksiyon ve sığ bir açıyla nöral tüp nüfuz edecektir. Sağ çapı microcapillary DNA ile zarar vermeden tüpün içine nüfuz ve düzenli bir soluk verme ile DNA serbest kolayca yüklenmiş olması gerekir. </li><li> Ağız pipet kullanarak DNA enjekte edilir. Yeşil boya, gelişmekte olan beynin veziküller kuyruk ucu yaymak gerekir. </li><li> Tüp kendisi ve nabız dokunmadan mümkün olduğunca yakın, nöral tüp paralel elektrotlar yerleştirin. Darbe zamanda, elektrotlar elektriksel iletkenlik sağlayan sıvı ile kaplı olmalıdır. Genellikle, Hank yalvarıyor eklendi miktarı yeterlidir. Eğer değilse bir damla Hank darbe hemen önce ekleyin. </li><li> Elektrotlar dikkatlice çıkarın ve bir bant ile pencere mühür. Yumurta tamamen sızdırmazlık için aşağıdaki kuluçka dönemi sırasında embriyo kurumasını önlemek için önemlidir. </li><li> Inkübatör yumurta geri yerleştirin. </li></ol> II. Omurilik açık-kitap hazırlanması Embriyo omurilik Dekolmanı <ol><li> Yumurta, E6, eletroporated embriyo çıkarın ve PBS içeren silikon kaplı bir Petri kabı yerleştirin. </li><li> Membranlar kesip ve ventral tarafta tutun pimleri kullanarak embriyo streç. </li><li> Keskin bir tungsten kullanma Beyin kuyruk aşağı, çatı levha boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak microcapillary. </li><li> Omurilik dorsal kök gangliyon (DRG) ayrılmakta, omuriliğin her iki tarafında ek bir iki uzunlamasına insizyonlar olun. </li><li> Omurilik zedelemeden, kuyruk Beyin başlayan doku taban plakası ile ayırın. </li><li> Ince makas kullanarak Beyin omurilik enine bir bölümünde kesin ve vücuttan ayrı. </li></ol> Tespit <ol><li> Silikon düz bir montaj hazırlık üreten kuyruk Beyin tutun pimleri kullanarak, PBS içeren ile kaplı yeni bir petri izole spinal kord sürün. </li><li> Çanak PBS dökün ve fosfat tamponlu salin içinde% 4 paraformaldehid ile değiştirin. </li><li> 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol> İmmünohistokimya <ol><li> Sabit omurilik PBS içinde primer antikor içeren bir şişeye aktarın. </li><li> 4 gece boyunca hafif ajitasyon ile inkübe ° C. </li><li> PBS ile antikor X5, süreleri, her yıkama nazik ajitasyon ile 1 saat yıkayın. </li><li> Sekonder antikor ekleyin ve 4 gece boyunca hafif ajitasyon ile inkübe ° C </li><li> Her antikor X5 kez PBS ile yıkayınnazik ajitasyon ile 1 saat süreyle yıkayın. </li></ol> Görüntüleme için açık bir kitap Montaj <ol><li> Smear gres veya silikon bir slayt üzerinde bir dikdörtgen şeklinde ve içinde PBS damla. </li><li> Cımbız ve Pasteur pipeti ile çevresinde sıvı çizmek kullanarak dikdörtgenin ortasında gergin omurilik yerleştirin. </li><li> Omurilik 1-2 damla montaj medya yerleştirin ve kapağı kayma ile kaplayın. Squash hava kabarcıklarını önlemek için. </li><li> 4 ° C&#39;de karanlıkta slaytlar tutun </li><li> Konfokal mikroskopi kullanılarak omurilik inceleyin. </li></ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

Civciv embriyo içine plazmid DNA Elektroporasyon in vivo ektopik ifade için güçlü bir teknik olarak gelişiyor. Özel arttırıcılar ve civciv elektroporasyon kombinasyonu nöronlar 1,3,5 genetik olarak tanımlanan bir grup aksonal yollar deşifre için hızlı ve etkili bir araç sağlar . Cre / LoxP ve Gal4/UAS amplifikasyon sistemlerinin kullanılması ifade düzeyleri ve süresini arttırır. Ortaya çıkan resim interneuron alt popülasyonlar, kendi aksonal projeksiyonlar yönü ile tanımlanan kaynaklanmaktadır aksonal ipuçlar...

nöronlar, genetik tanımlı gruplar aksonal tanımında kullanılması civciv nöral tüp deşifre ovo elektroporasyon

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Nöronlarda muhabiri genlerin ifade sürücü İstihdam artırıcı unsurları aksonal projeksiyon izlemek için yaygın olarak kullanılan bir paradigma. Omurgalılarda spinal internöronlar aksonal projeksiyon izleme, germ line-hedefli muhabiri genler bilateral simetrik etiketleme verim. Bu nedenle, IPSI ve kontra-yanal projelendirme aksonlar ayırt etmek zordur. Civciv nöral tüp tek taraflı elektroporasyon, merkezi sinir sisteminin bir tarafı bir muhabir gen ifadesini sınırlamak ve her iki tarafta aksonal projeksiyon takip etmek faydalı bir araç sağlar<sup&gt; 1 ,2-5</sup&gt;. Bu video ilk enjeksiyon öncesinde yumurta nasıl işleneceğini gösteriyor. HH evre 18-20, DNA sakral nöral tüp içine enjekte edilir, daha sonra tungsten elektrotlar embriyo paralel olarak yerleştirilir ve kısa bir darbe jeneratörü elektrik darbeleri ile yönetilmektedir. Yumurta bandı ile kapatılmış ve daha da geliştirilmesi için bir inkübatör içine geri yerleştirilir. Üç gün sonra (E6) omurilik, embriyo açık bir kitap hazırlık olarak kaldırılır sabit ve tüm montaj antikor boyama için işlenmiş. Lekeli omurilik slayt monte edilir ve konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi.

Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl gösterir<em&gt; Ovo</em&gt; Muhabiri genlerin kontrolü altında belirli artırıcı unsurların elektroporasyon.

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Nöronlarda raporlayıcı genlerin ekspresyonunu yönlendirmek için enhancer elementlerinin kullanılması, aksonal projeksiyon takibinde yaygın olarak kullanılan bir paradigmadır. Takip için...

Merhaba, ben Kudüs İbrani Üniversitesi tıp nörobiyoloji bölümündeki Dr. Review Klar laboratuvarından Ham. Merhaba, ben Sophie Esman, ben de Lars laboratuvarındayım. Bugün sizlere in vivo elektroporasyon ve omurilik açık kitap hazırlama prosedürünü göstereceğiz.Laboratuvarımızda bu prosedürü, embriyonik omurilikteki genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonların aksonal yollarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamak için, döllenmiş beyaz leghorn tavuk yumurtalarını oda sıcaklığından, tercihen sallantılı tepsileri olan 37 ile 38 °C arasındaki nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın.Canlı ve senkronize embriyolar elde etmek için inkübatörün sıcaklık ve neminin izlenmesi önemlidir. Civciv embriyoları, enhancer bağımlı spesifik ekspresyon için optimal bir evre olan hamburger ve Hamilton veya HH evre 18 ile 20'ye ulaştıklarında elektropore edilir. Bu evrede baş, gövdeye dik açıdadır.Ayrıca HH evre 18 ila 20'de, anterior, posterior sağ ve sol vital hat damarları gibi geniş bir ekstra embriyonik kan damarı seti de görülmelidir. Civciv embriyoları 66 saatlik inkübasyonun ardından HH evre 19 ila 20'ye ulaşır; bu aşamada yumurtalar inkübatörden çıkarılmalıd

deciphering-axonal-pathways-genetically-defined-groups-neurons-chick

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

Işlevi ve orta beyin dopaminerjik nöron gelişimi sırasında genlerin düzenlenmesi değerlendirmek için, içeren bir yöntem...

Dopaminerjik Nöron Geliştirme Gen Fonksiyonunun Çalışılması için Chick orta beyin içinde ovo Elektroporasyon yılında

Nöral tüp içinde gen ekspresyonunu bir hücre tipine özgü, izlenebilir bir şekilde aşağı regüle olabilen göre bir yöntem tarif edilmektedir. Biz nasıl...

Open-kitap Hazırlıklarında Dii Enjeksiyon tarafından geliştirilmesi Nöral Tüp ve fenotipleri Değerlendirilmesinde miRNA tabanlı Plazmidler arasında ovo Elektroporasyon yılında

Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.

Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon

Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH'a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin'in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

Bu video, in ovo elektroporasyon ile transfeksiyon sonrası diseke civciv embriyonik omurilik örnekleri üzerinde tüm transkriptom analizi yapmak için temel adımları göstermektedir.

Electroporated Chick Embriyonik Omurilik Diferansiyel Gen İfade RNA Sıra Analizi

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Öğrenin, civciv embriyonik omurilikte genetik olarak tanımlanmış nöronların aksonal yollarını in ovo elektroporasyon ile görselleştirme yöntemini. Bu teknik nöral devre gelişimini araştırmak için değerlidir.

Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon

Daha fazla video keşfet