Nöronlar, Genetik Tanımlı Gruplar Aksonal tanımında kullanılması Civciv Nöral Tüp Deşifre Ovo Elektroporasyon
2 Mayıs 2010
Bu video nöronların genetik olarak tanımlanan gruplar aksonal yollar kullanarak embriyonik civciv omurilik görselleştirmek için nasıl gösterir Ovo Muhabiri genlerin kontrolü altında belirli artırıcı unsurların elektroporasyon.
Merhaba, ben Kudüs İbrani Üniversitesi tıbbi nörobiyoloji bölümündeki Dr.Review Klar'ın laboratuvarından Ham. Merhaba, ben Sophie Esman ve aynı zamanda bir Lars laboratuvarındanım. Bugün size Innovo, elektroporasyon ve omurilik açık kitap hazırlama için bir prosedür göstereceğiz.
Laboratuvarımızda bu işlemi, embriyonik omurilikteki genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonun aksonal yörüngelerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bu işleme başlamak için, döllenmiş beyaz leghorn tavuk yumurtalarını oda sıcaklığından nemlendirilmiş bir inkübatöre, tercihen 37 ila 38 santigrat derecede sallanan tepsilere aktarın.
Canlı ve senkronize embriyolar elde etmek için inkübatörün sıcaklığını ve nemini izlemek önemlidir. Civciv embriyoları, hamburger ve Hamilton veya HH evresi 18 ila 20'ye ulaştıklarında elektroporasyona tabi tutulur, bu da arttırıcı bağımlılığa özgü ifade için en uygun aşamadır. Bu aşamada, baş gövdeye dik açılarda uzanır.
Ayrıca HH evre 18 ila 20'de, ön, arka sağ ve sol hayati hat damarları gibi geniş bir ekstra embriyonik kan damarları seti de görülmelidir. Civciv embriyoları 66 saatlik kuluçka işleminden sonra HH evresi 19 ila 20'ye ulaşır ve bu sırada yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın Yumurtaları çıkardıktan sonra yatay olarak yerleştirin ve beş ila 10 dakika bekleyin. Embriyo şimdi yumurtanın üst kutbunda bulunur.
Elektroperingden önce, embriyolar Hank'in çözeltisini mililitre penisilin başına 100 birim ve mililitre streptomisin başına 0.1 miligram ile hazırlar. Mikrolitre başına iki ila beş mikrogramda istenen bir DNA karışımını hazırlayın ve enjekte edilen DNA'nın kolay görselleştirilmesi için hızlı yeşil boyadan birkaç tane ekleyin. Bir ağız pipeti, steril bir şırınga iğnesi, küçük bir makas ve bir bant da hazır bulundurun.
0,5 milimetre çapındaki cam kılcal damarları pipet çektirme ile çekerek mikro kılcal damarları hazırlayın. Tungsten elektrotları mikro manipülatörlere yerleştirin ve elektrotları darbe üretecine bağlayın. Darbe üretecindeki voltajı eksi 30 volta, her darbenin uzunluğunu 50 milisaniyeye ve darbe sayısını üçe ayarlayın.
Embriyoları açığa çıkarmadan ve işlemeden önce elektroporasyona devam edin. Yumurtanın dar kutbuna bir şırınga yerleştirin ve her yumurtadan beş ila altı mililitre albümin çıkarın. Albümin, dökülmesini önlemek için çıkarılır.
Bir sonraki adımda keserken, kesmek için küçük makası kullanın. Civciv embriyosunu ortaya çıkardıktan sonra yumurtanın üst tarafında oval bir pencere açın, 0,5 ila bir mililitre çile ve penisilin streptomisin çözeltisi ile nemlendirin. Ardından, cam mikro kılcal damarı yüklemek için bir ağız perpeti kullanın.
Bir DNA boya karışımı ile, doğru çaptaki bir mikro kılcal damar DNA ile kolayca yüklenmelidir. Binoküler bir pozisyon altında, DNA'yı nöral tüpe enjekte etmek için embriyo. Embriyoyu kuyruğu size bakacak şekilde yerleştirin.
Bu gelişim aşamasında, omurilik açıkça görülebilir ve bu nedenle zıt tekniklere gerek yoktur. Omurilik hem baş hem de kuyruk ucunda mühürlenmiştir. Bununla birlikte, mikro kılcal damarlar nöral tüpte daha fazla delik açar ve sığ bir açıyla nüfuz eder, yeterince ince ve doğru çapta bir mikro kılcal damar tüpe zarar vermeden nüfuz etmelidir.
DNA'yı bir ağız perpeti kullanarak enjekte edin. Doğru çaptaki bir mikro kılcal damar, DNA'yı düzenli bir ekshalasyon ile serbest bırakmalıdır. Yeşil boya, kuyruğun ucundan gelişmekte olan beynin veziküllerine kadar yayılmalıdır.
Nöral tüp DNA ile dolana kadar enjekte edin, enjekte edilen DNA'nın hücrelere girmesi için elektroporasyon gereklidir. Elektrotları nöral tüpe paralel olarak ve tüpün kendisine dokunmadan mümkün olduğunca yakın yerleştirin. Darbe sırasında elektriksel iletkenliğe izin vermek için elektrotların sıvı ile kaplandığından emin olun.
Genellikle embriyo açığa çıktıktan hemen sonra eklenen Hank solüsyonu yeterlidir. Ancak, elektrotlar konumlandırılmış ve elektro çalışmaya başlamak için sıvı darbeye batırılmışken, darbeden hemen önce Hank'in çözeltisinden bir damla değilse, elektrotları dikkatlice çıkarın ve pencereyi ve yumurtayı bantla kapatın. Bir sonraki kuluçka döneminde embriyonun kurumasını önlemek için yumurtayı tamamen kapatmak önemlidir.
Yumurtayı kuluçka makinesine geri yerleştirin ve civciv embriyosu gelişimsel embriyonik seviyeye ulaşana kadar kuluçkaya yatırın. Altıncı veya E altıncı gün, elektroporasyonlu embriyonun gelişimsel embriyonik seviyeye ulaştığı görüntüleme zamanı geldiğinde. Altıncı gün, E altı elektroporasyondan üç gün sonra, yumurtadan çıkarın ve ince makas kullanarak PBS içeren silikon kaplı bir Petri kabına yerleştirin.
Zarları kesin ve yerinde tutmak için silikonun içine itilen pimleri kullanarak embriyoyu ventral tarafına gerin. Keskin bir tungsten mikro kılcal damar kullanarak. Arka beyinden kuyruğa kadar tavan plakası boyunca uzunlamasına bir kesi yapın.
Omuriliğin her iki tarafında iki ek uzunlamasına kesi yapın, dorsal kök gangliyonlarını veya DRG'leri omurilikten ayırın. Omuriliği sağlam bırakarak taban plakasını kuyruktan başlayarak arka beyne kadar olan dokudan ayırın. Son olarak, omuriliği arka beyinde enine bir kesitte kesmek için ince makas kullanın ve omuriliği vücuttan ayırın.
Artık omurilik izole edildiğine göre, arka beyinden kuyruğa doğru tutmak için pimler kullanarak PBS içeren yeni bir silikon kaplı Petri kabına yayın ve düz bir montaj hazırlığı elde edin. İmmünohistokimya prosedürünü takiben omuriliği, omuriliği açık tutmak için ayrıntılı ve eşlik eden yazılı protokolü takiben oda sıcaklığında immüno boyasında bir saat boyunca PBS'de% 4 paraldehitte sabitleyin. Görüntüleme için kitap hazırlığı.
Bir slayt üzerine dikdörtgen şeklinde gres veya silikon yayın ve dikdörtgenin içine PBS damlatın. Omuriliği yerleştirmek için cımbız kullanın, dikdörtgenin ortasını gerin ve etrafındaki sıvıyı dışarı çekin. Evcil hayvan başına bir makarna ile omuriliğin üzerine bir ila iki damla montaj ortamı yerleştirin ve bir kapak fişi ile örtün.
Kapak kızağına baskı uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek için. Slaytları dört santigrat derecede karanlıkta tutun.
Konfokal mikroskopi kullanarak omuriliği inceleyin. Burada, RFP'nin CMV'den her yerde bulunan bir arttırıcı eleman kullanılarak tüm nöronlarda eksprese edildiği, nöronların ve aksonlarının çoğunun etiketlendiği kontrol deneylerinde civciv spinal inter nöronlarının aksonal reddinin bazı temsili sonuçları verilmiştir. Nöronal alt popülasyonların aksonal yörüngesini deşifre etmek imkansızdır.
Bununla birlikte, spesifik geliştirme elemanları uygulanırken, bu örnekte belirli bir alt popülasyon DI iki nöronun tanımlanmış bir aksonal yolu ortaya çıkar. Bu yüzden size E üçte belirli bir nöronal güçlendirici ile bir yanak nöral tüpünü nasıl elektro çalıştıracağınızı ve E altıda açık bir kitap omuriliğini nasıl hazırlayacağınızı gösterdik. Bu işlemi yaparken dikkatli ve sabırlı olmayı unutmamalısınız.
İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar. İyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, embriyonik tavuk omurilik kordonunda genetik olarak tanımlanmış nöronların aksonal yolaklarını görselleştirmek için in ovo elektroporasyon kullanan bir prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, araştırmacıların aksonal yörüngeleri etkili bir şekilde incelemesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Elektrofizyoloji
Arka Plan
- Aksonal yolakları anlamak sinirbilim araştırmaları için çok önemlidir.
- In ovo elektroporasyon, raportör genlerin tanıtılmasında kullanılan bir tekniktir.
- Embriyonic tavuk omurilik kordonu, nöron gelişimini incelemek için bir model olarak hizmet vermektedir.
- Genetik olarak tanımlanmış nöronel popülasyonlar, belirli sinir devreleri hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonic omurilik kordonunda aksonal yolakları görselleştirmek.
- Gen ekspresyonu çalışmaları için in ovo elektroporasyonu kullanmak.
- Nöronel gelişim ve bağlantı hakkındaki anlayışımızı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemli bir kuluçka makinesine aktarın.
- Kuluçka işlemini 37 ila 38 derece Celsius arasında sürdürün.
- Raportör genleri tanıtmak için in ovo elektroporasyon gerçekleştirin.
- Görselleştirme için omurilik açık kitap preparatları hazırlayın.
Ana Sonuçlar
- Omurilik kordonunda aksonal yolakların başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- In ovo elektroporasyonun etkinliğinin gösterilmesi.
- Genetik olarak tanımlanmış nöronel popülasyonların yörüngelerine dair içgörüler.
- Nöronel gelişimi çalışmaları için güvenilir bir yöntemin kurulması.
Sonuçlar
- Bu yöntem sinirbilim araştırmaları için değerli bir araç sağlamaktadır.
- In ovo elektroporasyon, embriyonic modellerde gen tesliminde etkilidir.
- Aksonal yolakları anlamak, sinir devresi oluşumu üzerine yapılan çalışmalara bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
