Name: İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Öğrenin, insan göbek kordonundan HUVEC izolasyonu ve kültürü için kollajenaz enzimi kullanarak damar biyolojisi araştırmalarında anjiyogenez analizleri yapma yöntemini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prosedür <ol><li> Aşırı kan kapalı temiz yastık ve dab kablosu yatırın. Kablosunun her iki ucunda da taze kesim olun. </li><li> Damar içine iğne ON plastik kılıflı 21 1 / 2 G iğne takın. (Ven en büyük açılış; 2 küçük olanları arterler) </li><li> Kelepçe bir hemostatla yerde iğne Hanks, 20cc şırınga ve iğne takın. </li><li> Orta basınç ile damar yoluyla Hanks itin. Beher çamaşır suyu ile atık toplayın. (Itme ven haşhaş iğne önleyecek tek elle iğne ve kordon Holding), damar içinde kan bir sürü varsa, ikinci bir kez yıkayın. </li><li> Pad üzerinde kablosunu Lay ve ven diğer ucunu kelepçe. Hanks kordon boyunca sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için birkaç mL ile doldurun. 5 ml çekiniz ve alt kelepçe kesmek. </li><li> 20cc şırınga çıkarın. 10cc şırınga pistonu çıkarın. 10ml kollajenaz dökmek ve piston yerine 10cc şırınga, iğne takın. Ilk miktarda açık ucunu çıkmak görene kadar, damar içine kollajenaz doğru itin. Açık ucunu yeniden kelepçe ve ven orta distansiyon kalmayıncaya kadar kollajenaz ile doldurun. Çok fazla düz kas kirlenme distansiyon sonuçlanır. </li><li> Kordon hafifçe masaj yapın. </li><li> 15 dakika için 37 DPBS kuluçkaya kablosu (bağlı hemostat, iğne ve şırınga ile) ° C. </li><li> Kuluçka iken, 2. kordon adımları 1-8 devam ediyor. </li><li> Inkübasyondan sonra, beher kablosu dışarı almak ve 50ml tüp üzerindeki kabloyu tutarken, alt kelepçe yukarıda ucu tüp içinde her şeyi toplamak için emin olun. Kablosu aracılığıyla kalan kollajenaz itin, sonra 20cc şırınga takın ve orta basınç yoluyla Hanks itin. </li><li> Herhangi bir düz kas hücreleri gerekmesi durumunda, şu anda kabloyu atın. Aksi takdirde, 37 ~ 5ml kollajenaz ve inkübe ikinci bir tüp içine 50 ml aynı kablosu ° C 30-60 dk. </li><li> Tüm kabloları yapılır kadar tüp tutun. </li><li> Tüpler 5 dakika için ~ 1200 rpm hızında dönerler. </li><li> Aspire süpernatant (yaklaşık 1-2 ml için hariç) bir T25 5mls PHEC pelet + ve plaka tekrar </li><li> Bir gecede 37 ° C ile% 5 CO 2 inkübe edin. </li><li> Ertesi gün süpernatantı kaldırmak ve taze medya ile değiştirin. Birçok eritrosit varsa, M199 ile PHEC + eklemek, sonra bir kez yıkayın. (1-4 gün) plaka konfluent kadar olağan olarak kuluçka devam edin. Jelatinize T75 böler. </li><li> Bir kez T75 üç T75s bölünür, konfluent. Başına iki şişe şişesi dondurun. </li></ol> Not: Endotel hücreleri (etkisizleştirilir) bir arnavut kaldırımlı bir görünüme sahip. Endotel hücreleri, bazen bir çift genellikle bir unactive devlet haline geri geçtikten sonra, sağ izolasyon sonra (uzun ve sivri) aktive edilir . Temizleme <ol><li> Çok dikkatli bir şekilde, kavuz konteyner iğneler atmayın. </li><li> Büyük biohazard konteyner şırınga atın. </li><li> Tüm doku, küçük bir biohazard torba içine koyun. -20 Yakın çanta ve dondurma ° yakma kadar. </li><li> Virüsit tüm araçların en az 10 dakika bekletin. </li><li> / Ağartıcı beher atık inkübasyon medya ekleyin. En az 10 dakika bekletin. </li><li> Tezgah pedleri biyolojik tehlikeli atık içine atın. </li><li> Bardak, masa üstü ve su banyosu vircide kapağı iç ve dış aşağı püskürtün. 10 dakika bekletin, sonra silin. </li><li> Ilık su ile durulayın ve beher ve araçları (Pas kalmaz araçların kapalı blot) kuruması için raf asmak. </li><li> Dekontamine atık lavabonun aşağı atın. </li><li> Kullanılmayan ortamları buzdolabı dönün. </li><li> Biyolojik tehlikeli atık eldiven atın. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>%0,1 Kollajenaz </td><td></td><td></td><td>kordon başına 10 mL, 37 &amp;deg;C'ye ısıtılmış</td></tr><tr><td>Doku kültürü flaskları</td><td></td><td></td><td>T75, kordon başına bir adet.</td></tr><tr><td>Hanks ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>makas</td><td></td><td></td><td>steril</td></tr><tr><td>beher</td><td></td><td></td><td>steril</td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (huvec)

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Anjiyogenez anjiyogenik uyaranlara yanıt olarak, yeni damarlar mevcut damarsal oluşturulan karmaşık çoklu adımlı bir süreçtir. Bu adımlar şunlardır: kabloları, lümen oluşumu, anastomoz, yeni bir bazal membran oluşumu ve ekstrasellüler matriks, AT uyum içine endotel hücreleri bazal membran, proliferasyon ve göç (çimlenme) (EC) bozulması. In vitro tayinlerde, bu süreç pek çok çalışma için geliştirilmiş, ancak çoğu sadece belirli aşamalarında anjiyogenez taklit ve morfolojik gemilerin çoğu in vivo gemileri benzemez edilmiştir. Burada bir insan umbilikal ven EC ve fibroblastlar kullanır in vitro anjiyogenez tahlil optimize göstermektedir. Bu modeli özetlediği önemlisi anjiyogenez en önemli erken aşamalarında, ve gemilerin, polarize EC çevrili patent hücrelerarası lümen gösterir. Gemiler, faz kontrast ve zaman atlamalı mikroskobu ile kolayca gözlenen ve downstream uygulamalar için saf formu ele olabilir.

Bu video protokolü insan göbek kordonu, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) izolasyonu ve kültürü göstermektedir. Bir kere bu hücreler, in vitro Hughes laboratuvar gösterdiği Optimize Fibrin Jel Boncuk Testi gibi anjiyogenez tayinlerde için kullanılabilir izole edilmiştir.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Anjiyogenez, anjiyojenik stimülasyonlara yanıt olarak mevcut vaskülatürden yeni damarların oluşturulduğu, çok basamaklı ve karmaşık bir süreçtir. Bu basamaklar ...

Merhaba, benim adım Jager Davis ve bugün size HUVEC olarak da bilinen insan göbek kordonu ven endotel hücrelerinin nasıl izole edileceğini göstereceğim. Bir dizi besiyeri kullanacağız; öncelikle, hücrelerimizi ven içinde bulunabilecek herhangi bir eritrosit veya diğer kontaminanlardan temizlemek için kullanılacak olan Hank Dengeli Tuz Çözeltisi'ni kullanacağız. İkinci olarak, DPBS içinde süspande edilmiş kollajenaz kullanacağız ve bu çözelti HUVEC'leri venden ayırmak için kullanılacaktır; ardından hücreleri, ısı ile inaktive edilmiş FBS ve pen-strep çözeltisi içeren M199 bazlı %20'lik büyüme besiyerine ekeceğiz.Resus süspansiyonumuzu ayrıca BD Biosciences marka endotelyal hücre büyüme takviyesi ile zenginleştireceğiz. Tamam, elimde bir çift diseksiyon makası var. Kordonu şu şekilde boydan boya keseceğim.Sıradaki adımda, kordonu temizleyeceğim. Bunun için arterleri ve veni tanımlayacağım. Burada iki arter ve bir ven bulunmaktadır.Arterleri genellikle ikisinden tanırım. Size doğru geliyorlar. Böylece tam burada bir tane ve tam burada bir başka arterimiz var.Gördüğünüz gibi, ven aslında korda giriyor ve kelebek iğnemizi buraya yerleştireceğiz. 21 gauge ve üç çeyrek Accutane kelebek iğne kullanıyoruz. Şimdi onu açın.Sadece bu şekilde devam edeceğim. Tekrar, arterleri tanımlayacağım. Birinci arterimiz, ikinci arterimiz ve ardından venimiz var.Şimdi kelebek iğneyi alıp çok nazikçe vene yerleştireceğim, ancak biraz dirençle karşılaşabilirsiniz. Bu durumda kordonu hafifçe döndürmeyi ve aynı anda iğneyi itmeyi, yani bu tarz bir hareket yapmayı tercih ediyorum ve kelebek iğnenin kanatları kordonla aynı hizaya gelene kadar bu şekilde devam ediyorum. Tamamdır, şimdi klempleyip sabitleyebilirsiniz.Şimdi yapacağım işlem, iki adet 20 µL'lik şırıngayı 20 µL mürekkeple doldurmaktır. Ardından, 50 µL'lik konik bir tüpü beş µL %20 effect ile dolduracağım. Son olarak, bu 15 µL'lik konik tüplerden birine 10 µL DPBS pipetleyeceğim.Bu 15 ml DPBS'nin içine, terazide tartacağım 10 mg kollajenaz tozunu ekleyeceğim. Toz tüpün çeperlerinden ayrılana kadar tüpü birkaç kez tersyüz ederek kollajenazı yeniden süspande edeceğim. Yaklaşık beş veya altı kez tersyüz ettikten sonra, filtreyi eklemek için 10 ml'lik bir şırınga kullanarak kollajenazı steril filtreleyeceğim.Şimdi bu besiyerlerini kordonla işleme almaya hazırız. Kalan DPPS'yi bu bir litrelik Beaker'a boşalttım ve ısınması için 37 derecelik su banyosuna yerleştireceğim. Bu, kordonumuzu yaklaşık 15 dakika boyunca inkübe etmek için kullanılacaktır.Bu, filtrelenmiş kollagenaz çözeltimizdir. Konik tüpü 37 derecelik su banyosuna yerleştirerek ısınmasını sağlayacağım ve bunu prosedürün ilerleyen aşamalarında, venin içindeki uveyi yerinden çıkarmak için kullanacağım. Bundan sonra yapacağım işlem, kordu kelebek iğnenin bulunduğu noktadan klemplemek ve kan hücrelerini temizlemek için korddan 20 ml hanks geçirmektir.Kelebek iğneyi sabitledikten sonra, 20 ml heparin çözeltisini enjekte edeceğim. Venin yırtılmasını önlemek için bu işlemi çok yavaş bir şekilde gerçekleştireceğim. Heparinin çıkış hızı yaklaşık olarak bu seviyede olmalı, ancak heparini hızla akıtmamalısınız.Bu, çok fazla baskı uyguladığınız anlamına gelir. Bu yüzden genellikle bunu, bilirsiniz, damla damla yaparım. Ve tekrar belirtmek gerekirse, damarı temizlemek için hanks çözeltisini itiyorum.Ardından uç hücrelerimizi açığa çıkarıyoruz. Böylece tüm askılarımızı geçirdiğimizde, kordonu sereceğim ve sonrasında kordonun alt ucunu klempleyip şırıngayı çıkararak biyotehlike torbasına yerleştireceğim.Sıradaki işlemde, yeni bir 10 ml'lik şırınga takacağım. Tamam, şimdi kordon boyunca kollagenaz iteceğim; bunu, venimizde kalmış olabilecek tüm artık kalıntıları temizlemek için yapıyorum. Kollagenazı sadece yeterli miktarda iteceğim.Böylece şuradaki uçtan dışarı çıktığında, renginin şırıngadakine yaklaşık olarak aynı olduğunu göreceğiz. Bundan sonra kordonun alt ucunu klempleyeceğim. Bir sonraki adımda, kordonun genişlediğini görebileceğimiz kadar az miktarda daha kollagenaz iteceğim.Biraz genişledikten sonra, soldan sağa doğru kordu masaj yapmaya başlayacağım. Genellikle üç parmağımı kullanarak orta sertlikte bir basınç uygularım. Bu işlem, neredeyse erişte hamuru açmaya benzer.Kordonu çok sert itmek istemezsiniz ancak çok yumuşak da davranmamalısınız. Eğer çok sert iterseniz, düz kas kontaminasyonu riskiyle karşı karşıya kalırsınız. Ancak çok nazik davranırsanız, herhangi bir Q'yu geri yerinden oynatamazsınız.Bu nedenle, bir noktada yaklaşık beş ila altı saniye bekleyin ve bu şekilde aşağıya doğru ilerleyin. Şimdi, kordonu masadan 37 °C'lik su banyosuna aktaracağım ve 15 dakika boyunca bekletip inkübe edeceğim. Bazı örnekleri 15 dakika boyunca inkübe etmeniz gerekebilir.Bir başka lot 20 dakika, üçüncü bir lot ise 10 dakika sürebilir. Bu nedenle, kullandığımız özel lot için inkübasyon süresini optimize etmek önemlidir. Burada süre 15 dakikadır.Kordonları DPVS banyosundan çıkaralım. Bir an için buraya bırakacağız. 5 ml %20 feck içeren 15 ml'lik konik tüpümüzün kapağını çıkarıyoruz.%20'lik fKS trypsin inhibitörü içerdiğinden kolajenazın etkisini durduracaktır. Bu nedenle, makasla kordonu tüpün üzerinde tutacağım. Şimdi yapacağım işlem, klembin olduğu hat boyunca kesmektir.Alt bölümü buraya taşıyorsunuz. Tamam, böylece kordonumuzun ucunda taze bir kesiğimiz oldu. Şimdi yapacağım işlem, kollagenazı içeriye itmek.Ve tekrar, tıpkı hankslerde olduğu gibi, çok hızlı itmek istemezsiniz. İmmüdyatınızı iletmeniz gereken hız yaklaşık olarak budur. Kollagenazımız için yapacaklarımız bunlardan ibarettir.Bazen şırınganın biraz fazla sıkı sabitlendiğini görebilirsiniz. Bu durumlarda yapacağım şey, göbek kordonunda kullandığımız klempi kullanmak ve temel olarak tam buradan tutup, gevşetmeye yetecek kadar nazikçe çevirmektir; böylece şırıngayı elimle çıkarabilirim veya şırınga kendiliğinden ayrılır. Ardından, elimizde kalan 20 ml'lik HANKS şırıngasını alıp iğnesine takacağım ve HANKS'in tüm hacmini iterek geçireceğim.Yine, tıpkı kolajenazda ve buradaki diğer hanks şırıngasında olduğu gibi, çok yavaşça iteceğim; damla damla geliyor. Medyayı bu hızda itmeniz gerekir. Bu karışım %20 hanks ve kolajenaz çözeltimizi içermektedir.Şimdi yapacağım işlem, örneği bir santrifüje yerleştirip 1200 RPM'de beş dakika boyunca döndürmektir. Kapağın güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin olmak için tekrar kontrol ediyorum. Ve şimdi örneği santrifüjümüze yerleştiriyorum.1200 RPM'de beş dakika boyunca santrifüj ettik. Böylece 50 ml'lik konik tüpümüzü 1200 RPM'de beş dakika santrifüj etmiş olduk. Geriye kalan ise tüpün dibinde küçük bir pelettir. Bu pelet, bazı kalıntı alyuvarlar ile endotel hücrelerimizden oluşmaktadır.Sırada, süpernatantı aspire edeceğim, peleti askıya alacağım ve 5 mL %20 FBS içeren DMEM ekleyip, süspansiyonda çok az kalıntı madde kalana kadar birkaç kez nazikçe pipetle yukarı aşağı çekeceğim. Ardından, 5 mL'nin tamamını pipetle alıp bir T25 flaska aktaracağım. Bunu yaparken hiç hava kabarcığı oluşmamasına dikkat etmeye çalışacağım.Şimdi ECPS'lerimi ekleyeceğim. 50 µL ekleyeceğim ve tüm ECPS'lerin kap içerisinde dağıldığından emin olmak için balonu hafifçe sallayacağım. Hepsi bu kadar.Devam edin. Erlenmayer balonu 37 derecede inkübe edildi.

isolation-of-human-umbilical-vein-endothelial-cells-huvec

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Göbek kordonu, farklı şekillerde düz kas hücreleri izole etmek için kullanılır. Bu çalışmada izole düz kas hücreleri için enzimatik tedavi kullanılır.

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. VEC tüberkülü veya broşürün her iki taraftan da izole edilmiş ve hemen şu olabilir, altta yatan interstisyel hücre (VIC) izolasyonu basittir.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Nötrofil yapışmasını ölçülmesi için bir yöntem rapor edilir. Bu yöntem, bir kan damarı karşılaşılan edilene benzer bir dinamik akış ortam oluşturur. Bu izin saflaştırılmış yapışma molekülleri (ligand) veya saf stres ile in vivo ortama benzer bir bağlamda endotel hücre alt-tabaka (HUVEC) ya da, nötrofil adhezyonunun araştırılması.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücresi (HUVEC) kültürü için protokoller, mikrotübül büyümesinin floresan işaretli belirteçlerinin geçici transfeksiyonu, canlı hücre görüntüleme ve interfaz mikrotübül büyüme dinamiklerinin otomatik analizi detaylandırılmıştır.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

Bu iletişim kuralının amacı göbek kordon kanı endotelyal progenitor hücrelerini izole etmektir. Bazı uygulamalar bu hücreler bir biyomarker hastaların kardiyovasküler riski ile iskemik hastalıklar, tedavi tanımlamak için kullanmayı içerir ve oluşturma doku Mühendisliği vasküler ve kalp kapak oluşturur.

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

Bu çalışma, gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemi kullanarak viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklamaktadır.

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

Öğrenin, insan göbek kordonundan HUVEC izolasyonu ve kültürü için kollajenaz enzimi kullanarak damar biyolojisi araştırmalarında anjiyogenez analizleri yapma yöntemini.

İnsan umbilikal ven endotel hücreleri İzolasyon (HUVEC)

Daha fazla video keşfet