Name: Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-09T17:05:05.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Öğrenin, DSP çapraz bağlayıcı kullanarak hücrelerde geçici protein etkileşimlerini stabilize etme ve immüno-manyetik afiniti kromatografisi ile protein komplekslerini izole etme yöntemini. Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında protein etkileşimlerini in vivo çalışmaya olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, VF için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NS42599 ve GM077569) hibe ile desteklendi.

1. Crosslinking için hazırlık <ol><li> 500 mg standart tüp reaksiyonu başına protein izolasyonu izin plaka için yeterli sayıda hücre gerekecektir. Bir tek tüp, immunoblotting faiz bir protein varsayılan interactors tanımlama için yeterli olabilir. Bu durumda, boncuk bağlı malzeme, SDS-PAGE örnek tamponu (immunoprecipitation) ile yıkandı olabilir. Kütle spektrometresi analizi için, standart reaksiyonlar sayısı en az on kat artmış olmalı ve protein kompleksleri kullanılan antikor (immünoafinite kromatografisi) tarafından tanınan bir peptid antijeni ile rekabet ile yıkandı, olmalıdır. Bu strateji, immünglobulin protein kompleksleri izolasyonu sağlayacaktır. </li><li> Crosslinking için en uygun hücre yoğunluğu% 75 ve% 90 confluency arasında. Yüksek confluency koşullarda, hücreler, tüm hücrelerin hücre geçirgen çapraz bağlayıcı erişilebilirlik azalır, birbirlerine kazık eğilimindedir. </li><li> Hücre tipi ve deneysel durum hücre plakanın alt tarafında etiketli olmalıdır. Biz rutin olarak tek başına araç ile kontroller içerir. </li><li> DSP çözümü DIŞINDA önce crosslinking tüm çözümler hazırlayın. <ol><li> CaCl 2 0.1 mM CaCl 2 deney başlamadan önce 1 mM (PBS / Ca / Mg) ile fosfat tamponlu salin tampon stok hazırlayın. Ayrıca kalsiyum ve magnezyum iyonlarının hücreleri deney sırasında kültür plakasına yapışması için kritik öneme sahiptir. 4 ° C saklayınız </li><li> 50X Komple Proteaz İnhibitör Kokteyl - 1 ml Milli-Q su içinde çözünmüş 1 tablet. -20 ° C'de muhafaza </li><li> % 20 Triton X-100 10g Triton X -100 dışarı tartılır ve 50 ml Milli-Q Su toplam hacmi içinde sulandırmak. Rock, 4 ° C 4 geceleme ve mağaza ° C kullanana kadar. 1 aydan fazla tutmayın. Bu% 20 hisse senedinin aşağıda açıklanan parçalama ve IP tamponlar hazırlamak için dilüsyonları kullanın. </li><li> PH 7.4 50X DSP Quenching Çözüm 1M TRIS. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 10x Tampon bir çözüm hazırlayın. 10X Tampon A: <ul><li> 50 mL 1 M Hepes </li><li> 150 mL 5 M NaCl </li><li> 10 ml 0.5 M EGTA </li><li> 250 mcL 2 M MgCl 2 </li><li> PH 7.4 'e ayarlayın </li><li> Son hacim 500 mL getirin </li></ul> 10X Tampon bir çözüm, bir ihtiyaç olarak 1X Buffer seyreltilir. 1x Tampon lizat ve immuno-manyetik yağış tamponlar kullanılır. A 1X Buffer <ul><li> 10 mM HEPES </li><li> 150 mM NaCl </li><li> 1 mM EGTA </li><li> 0.1 mM MgCl 2 </li><li> pH: 7.4 </li></ul></li><li> Lizis Tampon 1X Buffer A +% 0.5 Triton X-100. </li><li> İmmüno-Manyetik Yağış Buffer (IP Tampon) 1X Buffer A +% 0.1 Triton X-100. </li></ol></li></ol> 2. Crosslinking Çözüm hazırlanması <ol><li> DSP çözümü hücrelere başvuran hemen önce hazırlayın. DSP son derece hidrofobik ve PBS / Ca / Mg tampon içine seyreltilmesi önce DMSO içinde çözülmüş olmalıdır. DSP DMSO 1 ml 40 mg çözülür. Bu 100 mM DSP (DSP molekül ağırlığı 404,42 g / mol dür) bir çözüm haline getirir. </li><li> PBS içine DSP / DMSO seyreltme kolaylaştırmak için 37 ° C sipariş PBS / Ca / Mg uygun bir hacmi ısıtmak için. Çeşit çeşit plaka boyutları için gerekli Hacimler: Ortalama 6-plaka 2 mL 10 cm plakası plaka başına 10 ml 15 cm plakası plaka başına 20 ml </li><li> DSP / DMSO sıcak PBS / Ca / Mg her 1 mL stok çözelti 10μL ekleyin. DSP eriyene kadar DSP / DMSO stok solüsyonu damla damla tekrarlanan karıştırma ekleyin. Her 1 mL PBS / Ca / Mg 10 mcL DMSO bir kontrol çözümü olun. </li><li> 10 dakika daha uzun bir buz-su banyosu tüm PBS / Ca / Mg çözümleri yerleştirin. </li></ol> 3. Hücreler Crosslinking için hazırlayın <ol><li> Crosslinking veya araç kontrol inkübasyon için tüm plakaları uyacak bir buz-su banyosu hazırlayın. </li><li> 37 ° C inkübatör plakalarını alın ve hemen buz-su banyosu içine koyun. </li><li> Buz gibi soğuk PBS / Ca / Mg hücreler iki kez yıkayın. (Bkz. bölüm 2.2), çapraz bağlayıcı inkübasyon için kullanacağınız aynı hacimde kullanın. </li><li> Ikinci yıkama çıkarın ve araç kontrolü veya DSP crosslinking tampon çözelti ya ekleyin. </li><li> Iki saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Plakalar tüm hücreleri çözümü ile kaplı olduğundan emin olmak için yaklaşık her yirmi dakikada bir kontrol etmelisiniz. DSP küçük bir miktar çözüm çökelerek görebilirsiniz. Bu normal bir durumdur. </li></ol> 4. DSP Reaksiyon inaktivasyonu <ol><li> PBS / Ca / Mg (her 1 mL PBS / Ca / Mg 20 mcL için 1 M Tris pH: 7.4) 20 mM Tris, pH 7.4 1X DSP soğutmadan çözüm hazırlayın. </li><li> Araç kontrol ve crosslinking çözümler çıkarın. </li><li> Inaktivasyon çözüm buz ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. </li></ol> 5. Hücre Lizis <ol><li> DSP su verme kuluçka sırasında,% 0.5 Triton Tampon X-100 ile komple proteaz inhibitörü kokteyl hücre lizis tamponu hazırlamak. Her 1 mL lizis tamponu için tam 20 mcL 50X stok solüsyonu ekleyin. </li><li> PBS / Ca / Mg, 15 dakika DSP su verme inkübasyon sonra, hücreler iki kez yıkayın. </li><li> 30 dakika lizis tamponu + 4 kaya hücreleri ve Komple ° C ekleyin. Bazı çeşit çeşit plaka boyutları için lizis tamponu hacimleri önerilmektedir: <ul><li> Ortalama 6-plaka 0,5 mL </li><li> 10 cm plakası plaka başına 1 ml </li><li> 15 cm plakası plaka başına 1 ml </li></ul></li><li> Parçalama işleminden sonra, plaka hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Proteaz aktivitesi en aza indirmek için, buz üzerinde lizatları tutmak için emin olun. </li><li> Spin hücre, en yüksek hızı (15.000 xg) bir tezgah üstü mini-santrifüj 15 dakika 4 ° C lizatları. </li><li> Taze bir tüpe süpernatantı Pipet. Pelet atın. </li><li> Protein düzeyleri analiz ve immunoprecipitation devam. </li></ol> 6. Immuno-manyetik Yağış Boncuk hazırlanması Not: Bu adım, genellikle 2 saat crosslinking inkübasyon doğrudan başından itibaren başlatılır. <ol><li> 30 Dynal immunomagnetic boncuk mcL, 500 mcL IP Buffer (Tampon 1x A +% 0.1 Triton X-100) ve mikrosantrifüj tüpler screwtop uygun miktarda antijen-antikor birleştirin. Negatif kontroller için antikor ücretsiz ve non-spesifik antikor tüpleri hazırlayın. Uygun miktarda antikor ayrı deneyler sırasında bireysel antijenlere göre tespit edilmelidir. Tüm IP tüpler Etiket. </li><li> IP tüpler iki saat boyunca oda sıcaklığında bir sonu aşırı uç rocker inkübe izin verin. Alternatif olarak, crosslinking 4 ° gün önce gece IP tüpler antikor ile inkübe edin. </li><li> Inkübasyondan sonra, tüpün alt kısmında boncuk toplamak için 10 saniyede hızlı bir mini-santrifüj yapın. </li><li> Tüpler tüp alt uzak manyetik boncuk çekin manyetik tutucu, içine kaydırın. Güvenli bir şekilde çıkış yolu boncuklar ile artık kolayca herhangi bir bağlanmamış antikor uzak yıkayabilirsiniz. </li><li> Bir jel yükleme ucu veya kuluçka tampon ve kaldırmak için herhangi bir bağlanmamış antikor P200 ucu gibi küçük bir delik aspiratör ucu kullanın. Inkübasyon hacmi kaldırıldı mümkün olduğu kadar erken IP Buffer 1 ml ekleyin. </li><li> Nazikçe yeniden askıya boncuk, boru kılıfı, ve tüm IP tüpleri üzerinde uç uç rotasyon ile 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> IP Buffer taze bir mililitre ile bir kez daha 5 dakika yıkama adım (6.3 6.6 yoluyla adımları) tekrarlayın. </li><li> Çapraz lizat boncuklar eklenmek üzere hazır olana kadar IP tüpler son yıkama inkübasyon kalır. </li></ol> 7. Immuno-manyetik Boncuk Çapraz Lizat inkübe <ol><li> Son yıkama spin immuno-manyetik bilye sonra, aşağı 10 saniye için bir mini-santrifüj. Sonra manyetik tutucunun içine tüpler kayma devam edin. </li><li> Yine küçük bir delik aspirasyon ucu kullanarak, tüpten kuluçka hacmi çıkarın. Hemen immuno-manyetik bilye içeren tüplere çapraz hücre lizatı (1 mcg / mL lizat varsayarak) 500 mcL ekleyin. Negatif kontrol olarak peptid rekabet olacak, uygun bir miktarda peptit bu noktada dahil edilmelidir. Önceki deneyler, uygun peptid rekabet koşulları belirlemek için yapılmalıdır. Alternatif olarak, bir negatif kontrol olarak lizat ücretsiz immuno-manyetik bilye olmasını isteyebilirsiniz. Bu durumda, hemen immuno-manyetik bilye + Komple Lizat Buffer (Tampon 1x A +% 0.5 Triton X-100) 500 mcL ekleyin. </li><li> Yavaşça boncuk tekrar süspansiyon. Yeniden süspanse boncuk, 2 saat için bir bitiş üzerinde uç dönme 4 ° inkübe edilmelidir. </li></ol> 8. Boncuk Sınırsız Lizat yıkayın <ol><li> Lizat bir mini-santrifüj 10 saniyelik hızlı bir dönüş yeterli inkübasyon süresi etti. Sonra tüpler manyetik tutucu içine kaydırın. Manyetik tutucu deney kalanı için bir buz banyosunda tutulmalıdır. </li><li> Küçük bir delik aspiratör ucu kullanarak, tüm bağlanmamış lizat çıkarın. Tüm bağlanmamış lizat kaldırıldıktan hemen sonra IP Buffer 1 ml ekleyin. </li><li> Tüp kap boncuklar ve yavaşça tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Boncuk boncuk peletleme adım (8.1) tekrar yeniden süspanse. </li><li> Yine tüm inkübasyon hacmi aspirat ve hemen IP Buffer 1 ml ekleyin, daha sonra tüp kap. </li><li> IP Tampon boncuk yavaşça tekrar süspansiyon. Yeniden süspanse boncuk üzerinde uç uç sallanan ile 4 ° az 5 dakika inkübe edin. </li><li> Boncuk yıkama adımları (8.4) 8.6 üzerinden 4 kez daha tekrarlayın. </li></ol> 9 - Örnek doğasını ve Boncuk toplama <ol><li> Içine tüm immuno-manyetik yağış tüpler yıkanır sonra tekrar tortu boncuk (8.1) ve slayt tüplermanyetik tutucu. </li><li> Immuno-manyetik bilye bağlı proteinler denatüre koşulları kaldırıldı. Aspire son IP Tampon yıkama ve manyetik sahibinden IP tüp kaldırmak. </li><li> 1x Jel Örnek Tampon tekrar tüpün alt kısmında havuz boncuk boncuk pelet Yukarıdaki IP tüp ekleyin. Örnek tampon miktarı kullanılmak üzere jel iyi büyüklüğüne bağlıdır. Jel Örnek Tampon yeniden süspanse boncuk almak için tüpün alt hafifçe dokunmanız gerekebilir. </li><li> Her IP tüpü için (9.3 üzerinden 9.2) denatüre işlemi tekrarlayın. </li><li> Jel Örnek Tampon yeniden süspanse immuno-manyetik bilye sonra 75 ısıtılır ° C denatüre işlemini tamamlamak için 5 dakika. </li><li> Sonra örnek batı blot SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırılabilir denatüre olmuştur. Boşaltılmış immuno-Manyetik Boncuk santrifüj yeniden pelet ve manyetik tutucu ile örnek kaldırılır olabilir. </li></ol> 10 Çapraz antijenik Peptitler Kompleksleri (immunoaffiniti Kromatografisi) Elüsyon. <ol><li> Immuno manyetik immunoprecipitation tüplerin sonra manyetik tutucu içine yeniden tortu boncuk (8.1) ve slayt tüpleri, yıkanmış edilmiştir. Süpernatant aspire ve 10 ul Tampon eklemek protein kompleksleri immunoisolation için kullanılan antikor tarafından tanınan antijenik peptit ile desteklenmiştir. 10-200 mcM verimli yürütülmesi için değişen konsantrasyonlarda test etmelidir. </li><li> 4 boncuk 2 saat süreyle inkübe ° C </li><li> Boncuk manyetik stand koyun ve 10 ml yıkandı, malzeme dikkatli bir şekilde kurtarabilirsiniz. Bu süpernatant kaydedin. </li><li> Tampon bir hızla boncuk yıkama ve yıkama atın. Boncuklar kaydedin. </li><li> 1X bir konsantrasyon kaydedilen süpernatant ve boncuklar Jel Örnek Tamponu ekleyin. Bu tüpler 75 ° C'de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Boncuk ve peptid eluat SDS-PAGE ile analiz edin. Eluat hem SDS-PAGE leke protein veya immunoblots (Şekil 1B) IgG arındırılmış olmalıdır. IgG Bu malzeme, kütle spektrometresi için uygundur. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1855/1855fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. AP-3 etkileşim protein kompleksleri ve membran proteinlerinin izolasyonu HEK293 hücreleri (A) veya PC12 hücreleri (B) araç kontrol varlığı ya da tedavi (DMSO, tek şerit Şekil 1A) veya DSP (hatta şerit Şekil 1A veya tüm Şekil 1B kulvar). Şekil Aydınlatılmış özleri yalnız boncuklarla (Şekil 1A, Lanes 3-4), transferrin reseptör antikorları (Şekil 1A, Lanes 5-6), ya da AP-3 δ antikorlar (Şekil 1A, Lanes 7-10 ya inkübe edildi. 1B, şerit 1-10). SDS-PAGE örnek tamponu (Şekil 1A) immün kompleksler ile yıkandı, bir başına Tampon veya (Şekil 1B, şerit 1-2), veya δ antijenik peptid amino asitler 680 710 karşılık artan konsantrasyonları ile desteklenmiş Tampon (Şekil 1B, şerit 3-10):;: insan δ-adaptin (1.923.266 gi AAD03777 NCBI). Bu peptid δ antikor bağlar. Peptid elüsyon sonra, süpernatantlar (S) ve boncuklar (B), immunoblotting (Şekil 1B) tarafından analiz edildi. Yanı sıra, clathrin ağır zincir (ÇHC), BLOK-1 altbirim pallidin ve HOPS karmaşık altbirim vps33b: δ, β3 ve σ3 alt birimden karşı antikor tespit AP-3, aşağıdaki çözünür faktörler coprecipitates membran fosfatidilinositol-4-kinaz tip II alfa (PI4KIIα) ve çinko taşıyıcı 3 (ZnT3) proteinleri. Peptid IgG ağır zincir fare yokluğunda Şekil süpernatant yıkandı, unutmayın. 1B.

<ol><li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hermansky-Pudlak+syndrome+protein+complexes+associate+with+phosphatidylinositol+4-kinase+type+II+alpha+in+neuronal+and+non-neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hermansky-Pudlak syndrome protein complexes associate with phosphatidylinositol 4-kinase type II alpha in neuronal and non-neuronal cells.</a> J Biol Chem. 284, 1790-1802 (2009).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate.</a> J Mol Biol. 104, 243-261 (1976).</li>
<li>Xiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+DSP%2C+a+reversible+cross-linker%2C+to+fix+tissue+sections+for+immunostaining%2C+microdissection+and+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using DSP, a reversible cross-linker, to fix tissue sections for immunostaining, microdissection and expression profiling.</a> Nucleic Acids Res. 32, e185-e185 (2004).</li>
<li>Craige, B., Salazar, G., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4-Kinase+Type+II+Alpha+Contains+an+AP-3+Sorting+Motif+and+a+Kinase+Domain+that+are+both+Required+for+Endosome+Traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4-Kinase Type II Alpha Contains an AP-3 Sorting Motif and a Kinase Domain that are both Required for Endosome Traffic.</a> Mol Biol Cell. 19, 1415-1426 (2008).</li>
<li>Newell-Litwa, K., Seong, E., Burmeister, M., Faundez, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+non-neuronal+functions+of+the+AP-3+sorting+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and non-neuronal functions of the AP-3 sorting machinery.</a> J Cell Sci. 120, 531-541 (2007).</li>
<li>Salazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zinc+Transporter+ZnT3+interacts+with+AP-3+and+it+is+Targeted+to+a+Distinct+Synaptic+Vesicle+Subpopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Zinc Transporter ZnT3 interacts with AP-3 and it is Targeted to a Distinct Synaptic Vesicle Subpopulation.</a> Mol Biol Cell. 15, 575-587 (2004).</li>
<li>Trinkle-Mulcahy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
</ol>

DSP, geçirgen bir zar, 12 Å bir ayırıcı kolu ile kimyasal indirgenebilir çapraz bağlayıcı geçici protein etkileşimleri 1,2,3,4 stabilize etmek için kullanılır. Burada adaptör kompleksi AP-3, 5 endosomes veziküller içine zarı proteinleri tanır ve sıralar çözünebilir bir protein kompleksi ile bu stratejinin bir örneğini verdi . AP-3 seçici çinko taşıyıcı ZnT3 ve lipid kinaz fosfatidilinositol-4-kinaz tip II alfa değil transferrin reseptör 1,4,6 bağlar. Biz bu gözlemler kütle spektrometresi...

<table><tbody><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Invitrogen</td><td>P4417</td><td>1 tableti 200 mL suda çözün; 1 mM final konsantrasyona ulaşacak şekilde MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ve 0.1 mM final konsantrasyona ulaşacak şekilde CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ekleyin</td></tr><tr><td>Ditiyobis (suksinimidil propiyonat) (DSP)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22585</td><td>Neme duyarlıdır, hava sızdırmaz kapta 4&amp;#x00B0;C'de saklayın</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO) Hybri-Max</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads, Koyun anti-Fare IgG</td><td>Invitrogen</td><td>110.31</td><td>Boncuklar koyun anti-tavşan olarak da mevcuttur</td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 mıknatısı</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr></tbody></table>

dayanıksız multi-protein kompleksleri izolasyonu in vivo kontrollü hücresel Çapraz bağlama ve immuno-manyetik afinite kromatografisi

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Hücresel makine dinamik doğası, sıklıkla geçici ve / veya zayıf protein dernekler üzerine inşa edilmiştir. Bu düşük afinite etkileşimleri ilgi bir protein etrafında izolasyon ve protein ağlarının belirlenmesi için sıkı yöntemleri engellemektedir. , Kimyasal crosslinkers kullanımı, böylece arıtma için biyokimyasal sınırlamalar atlayarak, labil etkileşimleri seçici istikrar sağlar. Burada bir ayırıcı bir kol ile bir homobifunctional çapraz bağlayıcı kullanır kültür hücreleri için mükellef bir protokol mevcut 12 Å, dithiobis (succinimidyl proprionate) (DSP). DSP molekülü bir disülfit bağ azaltılması bölünmüş. Manyetik boncuklar ile ilgi proteinlerin immünoafinite kromatografisi ile kombine Çapraz bağlama, aksi arıtma dayanamaz protein kompleksleri izolasyonu sağlar. Bu protokol düzenli western blot teknikleri ile uyumlu ve kütle spektrometresi 1 protein tanımlanması için büyütülüyor olabilir. Stephanie A. Zlatic ve Pearl V. Ryder, bu çalışmaya eşit katkıda bulundu.

Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil etkileşimleri<em&gt; In vivo</em&gt; Sıkı protein kompleksi arıtma teknikleri kullanarak kendi izolasyon sağlar. Burada immunoprecipitation protein kompleksleri izolasyonu, kültürde yetişen crosslinking hücreler için kullanılan bir tekniktir.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Hücresel mekanizmaların dinamik doğası, sıklıkla geçici ve/veya zayıf protein etkileşimleri üzerine kuruludur. Bu düşük afiniteli etkileşimler ...'yi engeller.

Çapraz bağlama ve ardından gelen immünopresipitasyon için; %80 ila %90 yoğunluktaki hücreler, PBS, kalsiyum, magnezyum veya sadece DMSO içerisinde 1 mM buz soğukluğundaki DSP ile inkübe edilir.Araç kontrolü. DSP, birbirine 12 angstrom mesafesindeki serbest ve bağlı uçları çapraz bağlayan, homo bifonksiyonel, membran geçirgen ve indirgenebilir bir çapraz bağlayıcıdır. Çapraz bağlama işleminin ardından hücreler lizize edilir ve standart kontroller kullanılarak immün çöktürme işlemleri gerçekleştirilir.Ardından protein kompleksleri, indirgeyici ajanların DSP'yi parçalamasıyla indirgeyici SDS page ile çözümlenir ve böylece immünoblot ile bireysel proteinlerin tanımlanması sağlanır. Merhaba, ben Emory Üniversitesi Hücre Biyolojisi Bölümü'ndeki Dr. Victor Fonde laboratuvarından Stephanie Ick. Ben de yine Fonde laboratuvarından Pearl Ryder.Bugün sizlere, kontrollü çapraz bağlamanın ardından immünomanyetik afinite kromatografisi kullanılarak protein komplekslerinin izolasyonuna yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, geçici ve labil protein etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Hücre tipini ve spesifik deneysel koşulu belirtmek için hücre plakalarının altına etiketleme yaparak başlayın. Buradaki pozitif sembol DSP ile tedavi edildiğini, negatif sembol ise yalnızca DMSO içeren araç kontrolünü ifade eder. Hücre ekimine hazırlamak için plakalara besiyeri ekleyin.Standart tüp reaksiyonu başına 500 mikrogram protein izolasyonuna izin vermek için HEK hücreleri bir ila beş seyreltme oranında ekilmiştir. Kütle spektrometrisi analizinden elde edilen sonuçların immünoblot ile doğrulanmasıyla, ilgi duyulan bir proteinin muhtemel bağlanma ortaklarını belirlemek için tek bir tüp yeterli olabilir. Standart reaksiyon sayısını en az 10 kat artırın.Çapraz bağlama deneyinde kullanılan çözeltilerin çoğunun stoklarını da hazırlayın. Bunlar arasında, 0.1 millimolar kalsiyum klorür ve bir millimolar magnezyum klorür ile desteklenmiş ve PBS kalsiyum magnezyum olarak adlandırılan PBS bulunmaktadır. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının eklenmesi, hücrelerin kültür plağına yapışması için kritiktir.Deney süresince çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Diğer stoklar arasında, pelet çözülene kadar her 20 dakikada bir vortekslenen çapraz bağlayıcı sönümleme çözeltisi, 50 X komple proteaz inhibitör kokteyli, 4 °C'de saklanan ve bir ay içinde kullanılması gereken %20 Triton X 100 ile 10 x ve 1 x Tampon A çözeltileri yer almaktadır.Tüm çözeltileri ekteki yazılı protokolte ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde hazırlayın ve saklayın. Son olarak, bir X tampon çözelti ve %0,5 TRITTON X 100'den oluşan lizis tamponunu ve bir X tampon çözeltiden oluşan immünomanyetik çöktürme tamponunu veya IP tamponunu hazırlayın.Plakaya ekimden iki gün sonra, hücreler çapraz bağlama için optimal olan %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaştığında %0,1 TRITTON X 101 ekleyin. Yüksek konfluens koşullarında hücreler üst üste yığılma eğilimindedir, bu da hücre geçirgen çapraz bağlayıcının tüm hücrelere erişilebilirliğinin azalmasına yol açar. Çapraz bağlama işlemi için hazır olana kadar plakaları inkübatöre geri yerleştirin.DSP Çapraz Bağlayıcı çözeltisini hücrelere uygulamadan hemen önce hazırlayın. DSP oldukça hidrofobiktir ve bu nedenle PBS kalsiyum magnezyum tamponuna seyreltilmeden önce DMSO içinde 100 millimolar konsantrasyona kadar çözülür. DSP'nin PBS kalsiyum magnezyum tamponu içindeki seyreltilmesini daha da artırmak için uygun hacmi ısıtın ve 10 microliters DSP ve DMSO stok çözeltisi ekleyin.Her bir mililitre ılık PBS kalsiyum magnezyum için, tüm DSP çözünene kadar tekrarlanan karıştırma işlemiyle D-S-P-D-M-S-O stok çözeltisini damla damla ekleyin. Ayrıca, her bir mililitre PBS kalsiyum magnezyum için 10 mikrolitre DMSO içeren bir taşıyıcı kontrol çözeltisi hazırlayın. DSP'yi seyrelttikten sonra, tüm PBS kalsiyum magnezyum çözeltilerini 10 dakikayı geçmeyecek şekilde buzlu su banyosunda bekletin.Ardından, deneyde kullanılan tüm plakaları alabilecek bir buzlu su banyosu hazırlayın. Hücreleri içeren kültür plakalarını 37 °C'lik inkübatörden çıkarıp derhal buzlu su banyosuna yerleştirin. Hücreleri, çapraz bağlayıcı ile inkübasyon için önceden hazırlanan hacimlerle aynı olacak şekilde, buz gibi soğuk PBS calcium magnesium ile iki kez yıkayın; altı kuyucuklu plakalar için kuyucuk başına 2 mL olacak şekilde hesaplayın ve bu şekilde devam edin.İkinci yıkamadan sonra, hücrelere ya tampon içerisinde çözünmüş DMSO olan araç kontrolünü ya da DSP çapraz bağlama tamponu çözeltisini ekleyin; buz üzerinde iki saat boyunca inkübe edin ve tüm hücrelerin çözeltiyle kaplı olduğundan emin olmak için yaklaşık her 20 dakikada bir kontrol edin. Bazı hücreler açığa çıkarsa, hücreleri tekrar eşit şekilde kaplamak için kabı eğip döndürün; az miktarda DSP'nin çökelmesi normaldir.Hücrelerle yapılan iki saatlik inkübasyon sırasında, inkübasyon süresi dolmadan önce, stok çözeltiyi PBS kalsiyum magnezyum ile seyrelterek 1X DSP sönümleme çözeltisi hazırlayın. Reaksiyona girmemiş DSP'yi inaktive ederek çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için kullanana kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun. İki saatlik süre dolduğunda, taşıyıcı kontrol ve çapraz bağlama çözeltilerini hücrelerden uzaklaştırın.Buz gibi soğuk DSP sönümleme çözeltisini ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Bu sırada, komple proteaz inhibitör kokteyl stokunu hücre lizis tamponu içerisinde 1:50 oranında seyreltin. 15 dakika dolduğunda, hücreleri kalsiyum magnezyumlu PBS ile iki kez yıkayın.Ardından, hücrelere proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponunu ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca sallayarak inkübe edin. 30 dakikalık hücre lizisinden sonra, hücreleri plakadan toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Proteaz aktivitesini en aza indirmek için lizatları buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.Hücre lizatlarını, masaüstü mini santrifüjde 15.000 G'lik maksimum hızda, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe pipetle aktarın ve peleti atın. Bradford deneyi kullanarak protein seviyelerini analiz edin ve immünopresipitasyon işlemine geçin. Vidalı kapaklı mikro santrifüj tüplerinde iki saatlik çapraz bağlama reaksiyonunu başlattıktan hemen sonra immünopresipitasyon hazırlıklarına başlayın.30 µL anti IgG immünomanyetik boncuğu 500 µL IP tamponu ile birleştirin. Hedeflenen proteine karşı olan antikoru ekleyin. Antikorun uygun miktarı, her bir antijen için ayrı ayrı belirlenmelidir.Ön deneylerde, boncuklar için olası negatif kontroller arasında antikor kullanılmaması, sadece boncukların kullanılması ve IP antikorunu manyetik boncuklara bağlamak için izotip kontrol antikoru boncukları yer alır. Oda sıcaklığında, iki saat boyunca end-over-end rocker (takla atan karıştırıcı) içinde inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, tüpleri hızlıca santrifüjleyin ve manyetik tutucuya yerleştirin. Boncuklar mıknatısın yan tarafında toplanacaktır.Bağlanmamış antikorları içeren solüsyonu uzaklaştırın ve boncukların kurumasını önlemek için onları hemen yıkayın. İki yıkama işleminden sonra, uygun tüplere 500 µL 1 mg/mL DSP negatif veya DSP pozitif hücre lizatı ekleyin. Ön deneylerde belirlenen konsantrasyonda immunojenik peptidin lizat boncuk karışımına eklenmesiyle, bu aşamada bir peptit kompetisyon negatif kontrolü hazırlanabilir.Bu aşamada hazırlanabilecek bir diğer olası negatif kontrol, boncuklara sadece 500 µL lizis tamponu eklenerek hazırlanan sadece tampon içeren veya lizat içermeyen reaksiyondur. Deneysel ve kontrol reaksiyonları için boncukları nazikçe resüspande edin. Boncukların parçalanmasına neden olacağı için vortekslemeyin; 4 °C'de, uçtan uca rotasyonla iki saat boyunca inkübe edin.İki saatin sonunda, lizatı manyetik tutucu yardımıyla uzaklaştırın. Boncukları, her biri bir mililitre IP tamponu ile toplam altı kez kısa süreli santrifüjleyerek yıkayın. Her yıkama işlemini dört °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Bağlı kompleksleri elüye etmek için, boncuk peletinin hemen üzerine IP tüpüne bir x jel örnek tamponu ekleyin. Boncukları tüpün dibinde toplamak için, tüm boncukların jel örnek tamponu içinde yeniden süspanse olmasını sağlamak amacıyla tüpün altına hafifçe vurun. Alternatif olarak, immünofinite izolasyonu için boncuklara immünojenik peptid ile desteklenmiş 30 µL tampon ekleyin.İmmunojenik peptidin gerekli konsantrasyonu ampirik olarak belirlenir. 10 ila 200 mikromolar arasında bir aralık test edildikten sonra, boncukları dört derecede iki saat boyunca inkübe edin ve tüplere her 30 dakikada bir hafifçe vurun. Elüye edilmiş kompleksleri içeren 30 mikrolitreyi uzaklaştırmak için manyetik tutucuyu kullanın, bunları temiz bir tüpe kaydedin, IP tamponu ile yıkayın ve boncukları saklayın.Her iki elüsyon yöntemi için boncuklara 1x jel örnek tamponu ekleyin. Proteinleri denatüre etmenin yanı sıra, jel örnek tamponunda yeniden süspanse edilen immünomanyetik boncukları 5 dakika boyunca 75 °C'de ısıtın. Bu adım aynı zamanda DSP molekülünü parçalayarak kompleksteki tekil proteinlerin çözünürlüğünün sağlanmasına olanak tanıyacaktır.Western blotting için SDS-PAGE jelindeki örnekler. Boşaltılmış immünomanyetik boncuklar, santrifüjleme ile uzaklaştırılabilir ve yüklemeden önce manyetik bir tutucu ile örnekten temizlenebilir. Eğer immünofinite EUA, hem SDS-PAGE protein boyaması hem de immünoblotlar ile IgG'den arınmışsa, kütle spektrometrisi için uygundur.Burada, çapraz bağlanmış ve çapraz bağlanmamış hücre lizatlarından elde edilen materyalin, AP üç alt birimine karşı monoklonal bir antikor kullanılarak gerçekleştirilen immünomanyetik çöktürme işleminin ardından yapılan western blot örneği verilmiştir. Delta çapraz bağlama, immünomanyetik izolasyonlar sırasında çapraz bağlanmamış örneklerde görülmeyen etkileşen proteinlerin tespit edilmesine olanak tanır. Negatif kontroller, hem çapraz bağlanmamış hem de çapraz bağlanmış örnekler için antikor içermeyen ve transferrin reseptörüne yönelik bir IgG kullanılarak yapılan antikor izotipine uygun kontrol ile hiçbir spesifik protein çöktürmesi olmadığını göstermiştir.Bu örnekte, IP antikoruna bağlı proteinleri geri kazanmak için afinite peptit elüsyonu kullanılmıştır. İmmüno antikorun süpernatan fraksiyonunda bulunmadığına ve peptit elüsyonu sırasında boncuk fraksiyonunda kaldığına dikkat edin. Kimyasal çapraz bağlayıcı DSP ve ardından immüno manyetik afinite saflaştırma kullanarak labil MultiPro komplekslerinin nasıl izole edileceğini göstermiş olduk.Bu prosedür uygulanırken, çapraz bağlama sırasında labil etkileşimleri korumak ve proteaz aktivitesini minimize etmek için hücre çözeltilerinin ve lizatların soğuk tutulması önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

isolation-labile-multi-protein-complexes-vivo-controlled-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Protein kompleksleri önemli hücre fonksiyonlarını katalize eder. Birçok temel komplekslerinin detaylı fonksiyonel ve yapısal karakterizasyonu rekombinant üretimi gerektirir. MultiBac özellikle ökaryotik protein ve kompleksleri ifade etmek için özel bir bakülovirüs / böcek hücre sistemidir. MultiBac açık erişim platformu ve faydayı maksimize için geliştirilmiş standart çalışma prosedürleri olarak uygulanmıştır.

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Çok bileşenli protein kompleksleri hücre fonksiyonu ve gelişme sırasında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada çapraz bağlayıcı in vivo daha sonra yapı-işlev analizi için çapraz bağlı kompleksler, ardından arıtma ardından Drosophila embriyolardan yerli protein komplekslerini izole etmek için kullanılan bir yöntem tarif eder.

Bir In vivo</emŞu Protein Kompleksler yalıtmak için> Çapraz yaklaşım Drosophila Embriyolar

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu el yazması Bimolecular uluslara benzeşme arıtma (BiCAP) protokolünü açıklar. BM complexed bireysel proteinler hem de konut projeleri hariç rakip bağlama ortaklarıyla oluşan iken bu roman yöntemi belirli yalıtım ve aşağı akım proteomik karakterizasyonu herhangi bir iki etkileşen proteinlerin kolaylaştırır.

Bimolecular tamamlayıcı benzeşme arıtma (BiCAP) tarafından parçalanmış çok protein sinyal kompleksleri

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Öğrenin, DSP çapraz bağlayıcı kullanarak hücrelerde geçici protein etkileşimlerini stabilize etme ve immüno-manyetik afiniti kromatografisi ile protein komplekslerini izole etme yöntemini. Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında protein etkileşimlerini in vivo çalışmaya olanak tanır.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi (Video) | JoVE Journal

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Daha fazla video keşfet