Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi
March 9th, 2010
Hücre geçirgen çapraz bağlayıcı DSP [dithiobis-(succinimidyl propiyonat)] stabilize geçici ve labil etkileşimleri In vivo Sıkı protein kompleksi arıtma teknikleri kullanarak kendi izolasyon sağlar. Burada immunoprecipitation protein kompleksleri izolasyonu, kültürde yetişen crosslinking hücreler için kullanılan bir tekniktir.
Çapraz bağlama için, ardından immünopresipitasyon yapılır. % 80 ila 90 yoğunluktaki prosedür hücreleri bir milimolar buz soğuğu ile inkübe edilir. Yalnızca PBS, kalsiyum, magnezyum veya DMSO'da DSP.
Araç kontrolü. DSP, homo iki işlevli membran geçirgen ve indirgenebilir bir çapraz bağlayıcıdır, serbest olarak çapraz bağlanır ve birbirinden 12 angstrom içinde anlamına gelir. Çapraz bağlanmayı takiben hücreler parçalanır ve standart kontroller kullanılarak immünoçökeltmeler gerçekleştirilir.
Protein kompleksleri daha sonra SDS sayfasını indirgeyerek, ajanların parçalanmış DSP'sini indirgeyerek çözülür ve tek tek proteinlerin immünobor ile tanımlanmasına izin verir. Merhaba, ben Emory Üniversitesi Hücre Biyolojisi Bölümü'nde Dr.Victor Fonde'nin laboratuvarından Stephanie Ick. Ve ben Pearl Ryder, yine Fonde laboratuvarından.
Bugün size kontrollü çapraz bağlama ve ardından immünomanyetik afinite kromatografisi kullanarak miprotein komplekslerinin izolasyonu için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedürü laboratuvarımızda geçici kararsız protein etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.
Hücre tipini ve belirli deneysel durumu belirtmek için hücre plakalarının altını etiketleyerek başlayın. Buradaki pozitif bir sembol, tedavi edilen DSP'nin yalnızca negatif bir DMSO araç kontrolünü içerdiğini gösterir. Hücre tohumlama plakasına hazırlamak için plakalara ortam ekleyin.
HEK hücreleri, standart tüp reaksiyonu başına 500 mikrogram protein izolasyonuna izin vermek için bir ila beş seyreltmede ekilir. Kütle spektrometresi analizinden immünoblo lekesi ile ilgilenilen bir proteinin varsayılan bağlanma ortaklarını tanımlamak için tek bir tüp yeterli olabilir. Standart reaksiyon sayısını en az 10 kat artırın.
Ayrıca, çapraz bağlama deneyinde kullanılan çözümlerin çoğunun saplarını hazırlayın. Bunlar, 0.1 milimolar kalsiyum klorür ve PBS kalsiyum magnezyum olarak adlandırılan bir milimolar magnezyum klorür ile desteklenmiş PBS'yi içerir. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının eklenmesi, hücrelerin kültür plakasına yapışması için kritik öneme sahiptir.
Deney süresince çözeltiyi dört santigrat derecede saklayın. Diğer stoklar arasında, pelet çözülene kadar her 20 dakikada bir girdap olan çapraz bağlayıcı su verme çözeltisi 50 X tam proteaz inhibitörü kokteyli bulunur. Dört santigrat derecede depolanan ve bir ay içinde kullanılması gereken% 20 Tritan X 100 ve 10 x ve bir x Tampon çözelti
.Tüm çözümleri ekteki yazılı protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hazırlayın ve saklayın. Son olarak, bir X tamponundan oluşan lizis tamponunu hazırlayın. A artı %0,5 TRITTON X 100 ve immünomanyetik çökeltme tamponu veya bir X tamponundan oluşan IP tamponu.
Kaplamadan iki gün sonra artı %0.1 TRITTON X 101, hücreler %80 ila %90 oranında co akıcılığına sahiptir, bu da çapraz bağlama için idealdir. Yüksek eş akıcılık koşullarında, hücreler birbiri üzerine yığılma eğilimindedir ve bu da hücre geçirgen çapraz bağlayıcının tüm hücrelere erişilebilirliğinde bir azalmaya yol açar. Çapraz bağlama için hazır olana kadar plakaları inkübatöre geri yerleştirin.
Hücrelere uygulamadan hemen önce DSP Crosslinker çözeltisini hazırlayın. DSP oldukça hidrofobiktir ve bu nedenle PBS kalsiyum magnezyum tamponuna seyreltilmeden önce DMSO'da 100 milimolar konsantrasyona çözülür. DSP'nin PBS kalsiyum magnezyum tamponuna, ılık ve uygun hacme seyreltilmesini daha da arttırmak için, 10 mikrolitre DSP ve DMSO stok çözeltisi ekleyin.
Her bir mililitre ılık PBS kalsiyum magnezyum için, tüm DSP eriyene kadar D-S-P-D-M-S-O stok çözeltisini damla damla ekleyin ve tekrar tekrar karıştırın. Ayrıca, her mililitre PBS kalsiyum magnezyum için 10 mikrolitre DMSO'luk bir araç kontrol solüsyonu hazırlayın. DSP'yi seyrelttikten sonra, tüm PBS kalsiyum magnezyum çözeltilerini buzlu su banyosunda 10 dakikadan fazla tutmayın.
Ardından, deneyde kullanılan tüm plakaları tutacak bir buzlu su banyosu hazırlayın. Hücreleri içeren kültür plakalarını 37 santigrat derece inkübatörden almaya devam edin ve hemen buzlu su banyosuna yerleştirin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS kalsiyum magnezyum ile iki kez yıkayın, daha önce çapraz bağlayıcı ile altı kez inkübasyon için hazırlanan aynı hacimleri kullanarak, kuyu plakası kuyucuk başına iki mililitre hesaplayın ve bu şekilde devam edin.
İkinci yıkamadan sonra. Hücrelere iki saat boyunca buz üzerinde inkübe edilen hücrelere tampon içinde çözünmüş DMSO veya DSP çapraz bağlama tampon çözeltisi olan araç kontrolünü ekleyin ve tüm hücrelerin çözelti ile kaplandığından emin olmak için yaklaşık her 20 dakikada bir kontrol edin. Bazı hücreler açığa çıkarsa, tabağı tekrar eşit şekilde kaplamak için eğin ve döndürün, az miktarda DSP'nin çökelmesi normaldir.
İki saatlik inkübasyon sona ermeden önce hücrelerle iki saatlik inkübasyon sırasında, sapı PBS kalsiyum magnezyum ile seyrelterek bir XDSP söndürme çözeltisi hazırlayın. Reaksiyona girmeyen DSP'yi etkisiz hale getirerek çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için kullanana kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun. İki saat dolduğunda, araç kontrolünü ve çapraz bağlama solüsyonlarını hücrelerden çıkarın.
Buz gibi soğuk DSP söndürme solüsyonunu ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Bu arada, tam proteaz inhibitörü kokteyl stoğunu bir ila 50 oranında hücre lizis tamponuna seyreltin. 15 dakika dolduğunda, hücreleri PBS kalsiyum magnezyum ile iki kez yıkayın.
Daha sonra proteaz inhibitörlerini içeren lizis tamponunu hücrelere ekleyin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede sallayın. 30 dakikalık hücre lizizinden sonra, hücreleri plakadan toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Proteaz aktivitesini en aza indirmek için lizatları buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.
Hücre lizatlarını 15.000 Gs'lik en yüksek hızda bir tezgah üstü mini santrifüjde dört santigrat derecede 15 dakika döndürün. Bradford testini kullanarak protein seviyelerini analiz edin ve immünopresipitasyona devam edin. Vidalı mikro santrifüj tüplerinde iki saatlik çapraz bağlama reaksiyonunu başlattıktan hemen sonra immünopresipitasyon için hazırlanmaya başlayın.
30 mikrolitre anti IgG immünomanyetik boncukları 500 mikrolitre IP tamponu ile birleştirin. İlgilenilen hedefe karşı antikoru ekleyin. Her bir antijen için uygun antikor miktarı belirlenmelidir.
Ön deneylerde, boncuklar için olası negatif kontroller, IP antikorunu manyetik boncuklara bağlamak için antikor, boncuk ve izotip kontrol antikor boncuklarını içermez. Oda sıcaklığında iki saat boyunca bir uç uç külbütörde inkübe edin İnkübasyonun sonunda, tüpleri hızlı bir şekilde döndürün ve manyetik tutucuya kaydırın. Boncuklar mıknatısın yanında yoğunlaşacaktır.
Bağlanmamış antikorlar içeren çözeltiyi çıkarın ve kurumasını önlemek için boncukları hemen yıkayın. İki yıkamadan sonra, uygun tüplere mililitre DSP negatif veya DSP pozitif hücre lizatı başına 500 mikrolitre bir mikrogram ekleyin. Bu aşamada, ön deneylerde belirlenen bir konsantrasyonda immünojenik peptitin lizat boncuk karışımına eklenmesiyle bir peptit rekabeti negatif kontrolü hazırlanabilir.
Bu aşamada hazırlanan bir başka olası negatif kontrol, sadece boncuklara 500 mikrolitre lizis tamponu eklenerek hazırlanan sadece bir tampon veya lizatsız reaksiyondur. Deney ve kontrol reaksiyonları için boncukları yavaşça yeniden askıya alın. Girdap yapmayın çünkü bu, boncukların kırılmasına neden olur, iki saat boyunca uçtan uca dönerek dört derecede inkübe edin.
İki saatin sonunda, manyetik tutucuyu kullanarak lizatı çıkarın. Boncukları bir mililitre IP tamponu ile toplam altı kez hızlı sıkın ve yıkayın. Her yıkamayı dört santigrat derecede beş dakika inkübe edin.
Bağlı komplekslerden kaçınmak için, boncuk peletinin hemen üzerindeki IP tüpüne bir x jel numune tamponu ekleyin. Boncukları tüpün dibinde bir araya getirmek için, tüm boncukların jel numune tamponunda yeniden süspanse edilmesini sağlamak için tüpün altına hafifçe vurun. Alternatif olarak, boncuklara immünojenik peptit ile takviye edilmiş 30 mikrolitre tampon A'da immünoafinite izolasyonu için.
İmmünojenik peptidin gerekli konsantrasyonu ampirik olarak belirlenir. 10 ila 200 mikromolar aralığı test ettikten sonra, boncukları iki saat boyunca dört derecede inkübe edin, her 30 dakikada bir tüplere hafifçe vurun. Kaçan kompleksleri içeren 30 mikrolitreyi çıkarmak için manyetik tutucuyu kullanın ve temiz bir tüpte saklayın, IP tamponu ile yıkayın ve boncukları kaydedin.
Her iki elüsyon yöntemi için boncuklara bir x jel numune tamponu ekleyin. Proteinleri denatüre etmenin yanı sıra, jel numune tamponunda 75 santigrat derecede beş dakika boyunca süspanse edilen immünomanyetik boncukları ısıtın. Bu adım aynı zamanda DSP molekülünü de sertleştirecek ve karmaşık çalışmadaki tek tek proteinlerin çözülmesine izin verecektir.
Bir SDS sayfasındaki numuneler batı lekeleme için jel. Boşaltılan immünomanyetik boncuklar, santrifüjleme ile itilebilir ve yüklemeden önce manyetik bir tutucu ile numuneden çıkarılabilir. İmmünoafinite EUA, hem SDS sayfasının protein boyası hem de immün lekeler nedeniyle IgG içermiyorsa, kütle spektrometresi için uygundur.
Burada, çapraz bağlı ve çapraz bağlı olmayan hücre lizatından bir batı lekesi materyali örneği ve ardından AP üç alt birimine karşı bir monoklonal antikor kullanılarak immünomanyetik çökeltme görülmektedir. Delta çapraz bağlama, immünomanyetik izolasyonlar sırasında çapraz bağlı olmayan numunelerde görülmeyen etkileşimli proteinlerin tespit edilmesini sağlar. Negatif kontroller, hem çapraz bağlı olmayan hem de çapraz bağlı numuneler için transferrin reseptörüne karşı yönlendirilmiş bir IgG kullanarak antikor içermeyen ve antikor izotipi eşleşen kontrol kullanılarak spesifik bir protein çekme hareketi göstermedi.
Bu örnekte, IP antikoruna bağlı proteinleri geri kazanmak için afinite peptit elüsyonu kullanıldı. İmmüno-antikorun süpernat fraksiyonunda bulunmadığına ve peptit elüsyonu sırasında atım fraksiyonunda kaldığına dikkat edin. Kimyasal çapraz bağlayıcı DSP'yi kullanarak kararsız MultiPro komplekslerini nasıl izole edeceğinizi ve ardından immünomanyetik afinite saflaştırmasını nasıl yapacağınızı gösterdik.
Bu prosedürü yaparken, çapraz bağlama sırasında kararsız etkileşimleri korumak ve proteaz aktivitesini en aza indirmek için hücre çözeltilerini ve lizatları soğuk tutmak önemlidir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, hücre geçirgen bir çapraz bağlayıcı olan DSP kullanarak hücrelerin çapraz bağlanması için bir yöntem sunar, bu da in vivo geçici protein etkileşimlerini stabilize etmek için kullanılır. Teknik, immünopresipitasyon yoluyla protein komplekslerinin izole edilmesine izin verir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Protein Etkileşimleri
Arka Plan
- DSP, homo bifonksiyonel zar geçirgen bir çapraz bağlayıcıdır.
- DSP, birbirine 12 angstrom uzaklıkta olan proteinleri çapraz bağlar.
- Bu teknik, geçici protein etkileşimlerinin çalışılmasını geliştirir.
- İmmünopresipitasyon, protein komplekslerini izole etmek için standart bir yöntemdir.
Çalışmanın Amacı
- Kültürlenmiş hücrelerde proteinleri çapraz bağlamak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Daha fazla analiz için protein komplekslerinin izole edilmesini kolaylaştırmak.
- In vivo protein etkileşimleri hakkındaki anlamayı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hücreler, PBS veya DMSO içinde 1 mM DSP ile kuluçkalanır.
- Hücreler, çapraz bağlandıktan sonra lize edilir.
- İmmünopresipitasyon, standart kontroller kullanılarak gerçekleştirilir.
- Protein kompleksleri analiz için izole edilir.
Ana Sonuçlar
- Çapraz bağlama yöntemi, protein etkileşimlerini etkili bir şekilde stabilize eder.
- İzole edilen protein kompleksleri, sıkı temizleme teknikleri kullanılarak analiz edilebilir.
- Bu yaklaşım, kontrollü bir ortamda geçici etkileşimlerin çalışılmasını sağlar.
- Sonuçlar, protein kompleksi araştırmalarında DSP'nin kullanımının yararlı olduğunu gösterir.
Sonuçlar
- DSP çapraz bağlama tekniği, araştırmacılar için değerli bir araçtır.
- Bu teknik, in vivo protein etkileşimlerinin çalışılmasını geliştirir.
- Bu yöntem, hücre biyolojisi ve nörobilimde yeni kavrayışlara yol açabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Isolation of labile multi-protein complexes using in vivo cross-linking and immuno-magnetic affinity chromatography addresses a critical gap in capturing transient or weak protein interactions that underpin cellular machinery. This capability enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points. The method supports robust portfolio decisions by enabling the identification of protein networks that are otherwise inaccessible to standard purification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Stabilizes transient protein interactions to clarify functional protein networks around targets of interest.
- Enables mechanistic de-risking by capturing weak or dynamic associations critical for pathway interrogation.
- Supports predictive confidence in target validation by providing access to otherwise labile complexes.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream immunoblot or mass spectrometry analysis.
- Facilitates assay standardization by enabling reproducible isolation of protein assemblies.
- Enables quantitative assessment of protein-protein interactions for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by preserving native protein complexes for identification.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting the study of disease-relevant protein networks.
- Reduces biological risk in preclinical models by ensuring detection of physiologically relevant interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical research, enabling robust characterization of protein complexes at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by stabilizing and isolating labile protein assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream immunoblot and mass spectrometry workflows.
- Analytics: Provides measurable readouts of protein complex composition, enabling comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Preserves disease-relevant complexes for biomarker alignment and preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for repeated use across diverse targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation of protein complexes, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, immunoprecipitation, and analytical techniques such as western blot and mass spectrometry.
- Needs access to cross-linking reagents, magnetic bead platforms, and cold-chain infrastructure for sample preservation.
- Demands rigorous cross-team standardization of controls and analytical protocols.
- Adaptable to various cultured cell systems but may require empirical optimization for each target or model.
- Limited to interactions within the cross-linker’s spacer arm and may not capture all relevant associations.
