Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

Çapraz bağlama ve ardından gelen immünopresipitasyon için; %80 ila %90 yoğunluktaki hücreler, PBS, kalsiyum, magnezyum veya sadece DMSO içerisinde 1 mM buz soğukluğundaki DSP ile inkübe edilir.

Araç kontrolü. DSP, birbirine 12 angstrom mesafesindeki serbest ve bağlı uçları çapraz bağlayan, homo bifonksiyonel, membran geçirgen ve indirgenebilir bir çapraz bağlayıcıdır. Çapraz bağlama işleminin ardından hücreler lizize edilir ve standart kontroller kullanılarak immün çöktürme işlemleri gerçekleştirilir.

Ardından protein kompleksleri, indirgeyici ajanların DSP'yi parçalamasıyla indirgeyici SDS page ile çözümlenir ve böylece immünoblot ile bireysel proteinlerin tanımlanması sağlanır. Merhaba, ben Emory Üniversitesi Hücre Biyolojisi Bölümü'ndeki Dr. Victor Fonde laboratuvarından Stephanie Ick. Ben de yine Fonde laboratuvarından Pearl Ryder.

Bugün sizlere, kontrollü çapraz bağlamanın ardından immünomanyetik afinite kromatografisi kullanılarak protein komplekslerinin izolasyonuna yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, geçici ve labil protein etkileşimlerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Hücre tipini ve spesifik deneysel koşulu belirtmek için hücre plakalarının altına etiketleme yaparak başlayın. Buradaki pozitif sembol DSP ile tedavi edildiğini, negatif sembol ise yalnızca DMSO içeren araç kontrolünü ifade eder. Hücre ekimine hazırlamak için plakalara besiyeri ekleyin.

Standart tüp reaksiyonu başına 500 mikrogram protein izolasyonuna izin vermek için HEK hücreleri bir ila beş seyreltme oranında ekilmiştir. Kütle spektrometrisi analizinden elde edilen sonuçların immünoblot ile doğrulanmasıyla, ilgi duyulan bir proteinin muhtemel bağlanma ortaklarını belirlemek için tek bir tüp yeterli olabilir. Standart reaksiyon sayısını en az 10 kat artırın.

Çapraz bağlama deneyinde kullanılan çözeltilerin çoğunun stoklarını da hazırlayın. Bunlar arasında, 0.1 millimolar kalsiyum klorür ve bir millimolar magnezyum klorür ile desteklenmiş ve PBS kalsiyum magnezyum olarak adlandırılan PBS bulunmaktadır. Kalsiyum ve magnezyum iyonlarının eklenmesi, hücrelerin kültür plağına yapışması için kritiktir.

Deney süresince çözeltiyi 4 °C'de saklayın. Diğer stoklar arasında, pelet çözülene kadar her 20 dakikada bir vortekslenen çapraz bağlayıcı sönümleme çözeltisi, 50 X komple proteaz inhibitör kokteyli, 4 °C'de saklanan ve bir ay içinde kullanılması gereken %20 Triton X 100 ile 10 x ve 1 x Tampon A çözeltileri yer almaktadır.

Tüm çözeltileri ekteki yazılı protokolte ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde hazırlayın ve saklayın. Son olarak, bir X tampon çözelti ve %0,5 TRITTON X 100'den oluşan lizis tamponunu ve bir X tampon çözeltiden oluşan immünomanyetik çöktürme tamponunu veya IP tamponunu hazırlayın.

Plakaya ekimden iki gün sonra, hücreler çapraz bağlama için optimal olan %80 ila %90 konfluens düzeyine ulaştığında %0,1 TRITTON X 101 ekleyin. Yüksek konfluens koşullarında hücreler üst üste yığılma eğilimindedir, bu da hücre geçirgen çapraz bağlayıcının tüm hücrelere erişilebilirliğinin azalmasına yol açar. Çapraz bağlama işlemi için hazır olana kadar plakaları inkübatöre geri yerleştirin.

DSP Çapraz Bağlayıcı çözeltisini hücrelere uygulamadan hemen önce hazırlayın. DSP oldukça hidrofobiktir ve bu nedenle PBS kalsiyum magnezyum tamponuna seyreltilmeden önce DMSO içinde 100 millimolar konsantrasyona kadar çözülür. DSP'nin PBS kalsiyum magnezyum tamponu içindeki seyreltilmesini daha da artırmak için uygun hacmi ısıtın ve 10 microliters DSP ve DMSO stok çözeltisi ekleyin.

Her bir mililitre ılık PBS kalsiyum magnezyum için, tüm DSP çözünene kadar tekrarlanan karıştırma işlemiyle D-S-P-D-M-S-O stok çözeltisini damla damla ekleyin. Ayrıca, her bir mililitre PBS kalsiyum magnezyum için 10 mikrolitre DMSO içeren bir taşıyıcı kontrol çözeltisi hazırlayın. DSP'yi seyrelttikten sonra, tüm PBS kalsiyum magnezyum çözeltilerini 10 dakikayı geçmeyecek şekilde buzlu su banyosunda bekletin.

Ardından, deneyde kullanılan tüm plakaları alabilecek bir buzlu su banyosu hazırlayın. Hücreleri içeren kültür plakalarını 37 °C'lik inkübatörden çıkarıp derhal buzlu su banyosuna yerleştirin. Hücreleri, çapraz bağlayıcı ile inkübasyon için önceden hazırlanan hacimlerle aynı olacak şekilde, buz gibi soğuk PBS calcium magnesium ile iki kez yıkayın; altı kuyucuklu plakalar için kuyucuk başına 2 mL olacak şekilde hesaplayın ve bu şekilde devam edin.

İkinci yıkamadan sonra, hücrelere ya tampon içerisinde çözünmüş DMSO olan araç kontrolünü ya da DSP çapraz bağlama tamponu çözeltisini ekleyin; buz üzerinde iki saat boyunca inkübe edin ve tüm hücrelerin çözeltiyle kaplı olduğundan emin olmak için yaklaşık her 20 dakikada bir kontrol edin. Bazı hücreler açığa çıkarsa, hücreleri tekrar eşit şekilde kaplamak için kabı eğip döndürün; az miktarda DSP'nin çökelmesi normaldir.

Hücrelerle yapılan iki saatlik inkübasyon sırasında, inkübasyon süresi dolmadan önce, stok çözeltiyi PBS kalsiyum magnezyum ile seyrelterek 1X DSP sönümleme çözeltisi hazırlayın. Reaksiyona girmemiş DSP'yi inaktive ederek çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için kullanana kadar çözeltiyi buz üzerinde tutun. İki saatlik süre dolduğunda, taşıyıcı kontrol ve çapraz bağlama çözeltilerini hücrelerden uzaklaştırın.

Buz gibi soğuk DSP sönümleme çözeltisini ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Bu sırada, komple proteaz inhibitör kokteyl stokunu hücre lizis tamponu içerisinde 1:50 oranında seyreltin. 15 dakika dolduğunda, hücreleri kalsiyum magnezyumlu PBS ile iki kez yıkayın.

Ardından, hücrelere proteaz inhibitörleri içeren lizis tamponunu ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca sallayarak inkübe edin. 30 dakikalık hücre lizisinden sonra, hücreleri plakadan toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Proteaz aktivitesini en aza indirmek için lizatları buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.

Hücre lizatlarını, masaüstü mini santrifüjde 15.000 G'lik maksimum hızda, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe pipetle aktarın ve peleti atın. Bradford deneyi kullanarak protein seviyelerini analiz edin ve immünopresipitasyon işlemine geçin. Vidalı kapaklı mikro santrifüj tüplerinde iki saatlik çapraz bağlama reaksiyonunu başlattıktan hemen sonra immünopresipitasyon hazırlıklarına başlayın.

30 µL anti IgG immünomanyetik boncuğu 500 µL IP tamponu ile birleştirin. Hedeflenen proteine karşı olan antikoru ekleyin. Antikorun uygun miktarı, her bir antijen için ayrı ayrı belirlenmelidir.

Ön deneylerde, boncuklar için olası negatif kontroller arasında antikor kullanılmaması, sadece boncukların kullanılması ve IP antikorunu manyetik boncuklara bağlamak için izotip kontrol antikoru boncukları yer alır. Oda sıcaklığında, iki saat boyunca end-over-end rocker (takla atan karıştırıcı) içinde inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, tüpleri hızlıca santrifüjleyin ve manyetik tutucuya yerleştirin. Boncuklar mıknatısın yan tarafında toplanacaktır.

Bağlanmamış antikorları içeren solüsyonu uzaklaştırın ve boncukların kurumasını önlemek için onları hemen yıkayın. İki yıkama işleminden sonra, uygun tüplere 500 µL 1 mg/mL DSP negatif veya DSP pozitif hücre lizatı ekleyin. Ön deneylerde belirlenen konsantrasyonda immunojenik peptidin lizat boncuk karışımına eklenmesiyle, bu aşamada bir peptit kompetisyon negatif kontrolü hazırlanabilir.

Bu aşamada hazırlanabilecek bir diğer olası negatif kontrol, boncuklara sadece 500 µL lizis tamponu eklenerek hazırlanan sadece tampon içeren veya lizat içermeyen reaksiyondur. Deneysel ve kontrol reaksiyonları için boncukları nazikçe resüspande edin. Boncukların parçalanmasına neden olacağı için vortekslemeyin; 4 °C'de, uçtan uca rotasyonla iki saat boyunca inkübe edin.

İki saatin sonunda, lizatı manyetik tutucu yardımıyla uzaklaştırın. Boncukları, her biri bir mililitre IP tamponu ile toplam altı kez kısa süreli santrifüjleyerek yıkayın. Her yıkama işlemini dört °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Bağlı kompleksleri elüye etmek için, boncuk peletinin hemen üzerine IP tüpüne bir x jel örnek tamponu ekleyin. Boncukları tüpün dibinde toplamak için, tüm boncukların jel örnek tamponu içinde yeniden süspanse olmasını sağlamak amacıyla tüpün altına hafifçe vurun. Alternatif olarak, immünofinite izolasyonu için boncuklara immünojenik peptid ile desteklenmiş 30 µL tampon ekleyin.

İmmunojenik peptidin gerekli konsantrasyonu ampirik olarak belirlenir. 10 ila 200 mikromolar arasında bir aralık test edildikten sonra, boncukları dört derecede iki saat boyunca inkübe edin ve tüplere her 30 dakikada bir hafifçe vurun. Elüye edilmiş kompleksleri içeren 30 mikrolitreyi uzaklaştırmak için manyetik tutucuyu kullanın, bunları temiz bir tüpe kaydedin, IP tamponu ile yıkayın ve boncukları saklayın.

Her iki elüsyon yöntemi için boncuklara 1x jel örnek tamponu ekleyin. Proteinleri denatüre etmenin yanı sıra, jel örnek tamponunda yeniden süspanse edilen immünomanyetik boncukları 5 dakika boyunca 75 °C'de ısıtın. Bu adım aynı zamanda DSP molekülünü parçalayarak kompleksteki tekil proteinlerin çözünürlüğünün sağlanmasına olanak tanıyacaktır.

Western blotting için SDS-PAGE jelindeki örnekler. Boşaltılmış immünomanyetik boncuklar, santrifüjleme ile uzaklaştırılabilir ve yüklemeden önce manyetik bir tutucu ile örnekten temizlenebilir. Eğer immünofinite EUA, hem SDS-PAGE protein boyaması hem de immünoblotlar ile IgG'den arınmışsa, kütle spektrometrisi için uygundur.

Burada, çapraz bağlanmış ve çapraz bağlanmamış hücre lizatlarından elde edilen materyalin, AP üç alt birimine karşı monoklonal bir antikor kullanılarak gerçekleştirilen immünomanyetik çöktürme işleminin ardından yapılan western blot örneği verilmiştir. Delta çapraz bağlama, immünomanyetik izolasyonlar sırasında çapraz bağlanmamış örneklerde görülmeyen etkileşen proteinlerin tespit edilmesine olanak tanır. Negatif kontroller, hem çapraz bağlanmamış hem de çapraz bağlanmış örnekler için antikor içermeyen ve transferrin reseptörüne yönelik bir IgG kullanılarak yapılan antikor izotipine uygun kontrol ile hiçbir spesifik protein çöktürmesi olmadığını göstermiştir.

Bu örnekte, IP antikoruna bağlı proteinleri geri kazanmak için afinite peptit elüsyonu kullanılmıştır. İmmüno antikorun süpernatan fraksiyonunda bulunmadığına ve peptit elüsyonu sırasında boncuk fraksiyonunda kaldığına dikkat edin. Kimyasal çapraz bağlayıcı DSP ve ardından immüno manyetik afinite saflaştırma kullanarak labil MultiPro komplekslerinin nasıl izole edileceğini göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, çapraz bağlama sırasında labil etkileşimleri korumak ve proteaz aktivitesini minimize etmek için hücre çözeltilerinin ve lizatların soğuk tutulması önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.