Name: Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 27 s
Description: Öğrenin, Hi-C yöntemiyle kromatin etkileşimlerini ve genomun üç boyutlu mimarisini nasıl haritalandıracağınızı. Bu teknik, kromozom bölgeleri ve ölçekli kromatin yapısı hakkında kapsamlı bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AP Aiden, XR Bao, M. Brenner, D. Galas, W. Gosper, A. Jaffer, A. Melnikov, A. Miele, G. Giannoukos, C. Nusbaum, AJM Walhout; A. Kosmrlj tartışmalar ve kod için teşekkür ederim , L. Wood, K. Zeldovich tartışmaları, görselleştirme ile yardım ve L. Gaffney ve B. Wong. Fannie ve John Hertz Vakfı lisansüstü burs, Milli Savunma Bilimi ve Mühendisliği yüksek lisans burs, NSF lisansüstü burs, Ulusal Uzay Biyomedikal Araştırma Enstitüsü, hiçbir hibe tarafından desteklenir. Ulusal İnsan Genomu Araştırma Enstitüsü (NHGRI) (EL) T32 HG002295; i2b2 (Biyoloji ve Hastabaşı entegre Bilişim), Brigham ve Kadın Hastanesi (LAM) Biyomedikal Computing NIH destekli Merkezi; hibe yok. NHGRI HG003143 ve Keck Vakfı ayırt genç bilim adamı ödülü (JD). Ham ve eşlenmiş Hi-C dizisi veri GEO veritabanı (tevdi edilmiştir <a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/">www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</a> üyelik yok). GSE18199. Ek görselleştirme. <a href="http://hic.umassmed.edu">http://hic.umassmed.edu</a> .

<ol><li>Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Kosak, S. T., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+the+genomic+organization+of+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation.</a> Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).</li>
<li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+sequence%3A+cellular+organization+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (2007).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Regulation+in+the+Third+Dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene Regulation in the Third Dimension.</a> Science. 319, 1793-1794 (2008).</li>
<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+through+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+and+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene regulation through nuclear organization.</a> Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li>
<li>Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).</li>
<li>Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+organization+of+active+and+inactive+chromatin+domains+uncovered+by+chromosome+conformation+capture-on-chip+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).</li>
<li>Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Conformation+Capture+Carbon+Copy+%285C%29%3A+A+massively+parallel+solution+for+mapping+interactions+between+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements.</a> Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).</li>
<li>Miele, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Cis-+and+Trans+Chromatin+Interaction+Networks+Using+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).</li>
<li>Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALLPATHS+2%3A+small+genomes+assembled+accurately+and+with+high+continuity+from+short+paired+reads%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+%22%5BJournal%5D)">ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads.</a> Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).</li>
</ol>

Hi-C yöntemi geçici patent (no. 61/100, 151), inceleme altında.

Biz kromatin etkileşimleri, tarafsız bir genom şekilde haritalama, genomun 3 boyutlu mimari okuyan bir yöntem mevcut. Önceki çalışma dışında bu teknoloji ayarlar en kritik deneysel adım künt uç ligasyonu önce çapraz parçalarının biter kısıtlama biotinlenmiş nükleotidlerin eklenmesi. Bu adımı başarıyla derin tüm ligasyonu kavşak sıralama sağlar ve Hi-C, kapsamı ve güç verir. Okunma sayısı sonuçta etkileşim haritalar kararı belirleyecektir. Burada, insan genomu için 1 Mb etkileşim harita ~ 30 milyon alignable okuma kullanarak sunulmaktadır. N bir faktör &#39;tüm amacı&#39; çözümü artırmak amacıyla, okur sayısı n 2 bir faktör artış olmalıdır. Hi-C tekniği kolayca kütüphane nesil sonra hibrid yakalama (genomun belirli bölümlerine hedef) ve bağlanmasından sonra kromatin immunoprecipitation (spesifik protein ile ilişkili bölgelerde kromatin çevreyi araştırmak) gibi diğer teknikleri ile kombine edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Proteaz inhibitörleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340-5ml</td><td>Adım 1.2</td></tr><tr><td>biotin-14-dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>19518-018</td><td>Adım 1.6</td></tr><tr><td>Klenow</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td>Adım 1.6 ve 2.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>Invitrogen</td><td>15224</td><td>Adım 1.9</td></tr><tr><td>T4 DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td>Adım 1.17 ve 2.2</td></tr><tr><td>10x ligasyon tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td>Adım 2.2 ve 3.4</td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td>Adım 2.2</td></tr><tr><td>Klenow (exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td><td>Adım 2.3</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavin C1 Boncukları</td><td>Invitrogen</td><td>650.01</td><td>Adım 3.2</td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz HC</td><td>Enzymatics</td><td>L603-HC-L</td><td>Adım 3.5</td></tr><tr><td>Phusion HF mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>F531</td><td>Adım 3.8</td></tr><tr><td>Ampure boncukları</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>A2915</td><td>Adım 3.9</td></tr></tbody></table>

hi-c: genomların Üç boyutlu mimari eğitim bir yöntem.

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

Kromozom üç boyutlu katlama genom compartmentalizes ve yakın mekansal yakınlığı 2-6 içine rehberleri ve arttırıcılar gibi uzak fonksiyonel elemanları, getirebilir. Kromozom organizasyon ve genom aktivitesi arasında ilişki Deşifre transkripsiyon ve replikasyon gibi, genomik süreçleri anlamada yardımcı olacaktır. Ancak, kromozom kat hakkında çok az bilinir. Mikroskopi lokusların aynı anda yüksek çözünürlükte çok sayıda ayırt etmek mümkün. Bugüne kadar, kromozom konformasyon yakalama (3C) ve sonraki uyarlamalar kullanarak kromozom etkileşimleri tespit genom çalışmaları imkansız 7-10 yapma, hedef lokusların bir dizi seçim gereklidir. Biz Hi-C, 3C tarafsız, genom moda uzun menzilli etkileşimleri belirleme yeteneğine sahip bir uzantısı. Hi-C, hücreleri etkileşim lokusların kovalent DNA-protein çapraz bağlantılar yoluyla birbirine bağlı olmayı neden, formaldehit ile sabittir. DNA daha sonra bir restriksiyon enzimi ile parçalanmış, bu lokuslar bağlı kalır. 5 &#39;çıkıntılar yanında, künt uç ligasyonu, çapraz bağlı DNA parçaları arasında ligasyonu olayları lehine seyreltik koşullar altında yapılır doldurulur biotinlenmiş kalıntı kurulmuştur. Ligasyonu ürünlerin genom kütüphane Bu sonuç, çekirdeğinde birbirine yakın başlangıçta parçaları çiftleri karşılık. Her ligasyonu ürün kavşak yerinde biotin ile işaretlenmiş. Kütüphane makaslanmış ve kavşak streptavidin boncuk aşağı çekti. Saflaştırılmış kavşak sonradan etkileşim parçalarının bir katalog, yüksek verimli bir sequencer kullanarak analiz edilebilir. Doğrudan temas matris analizi, kromozom topraklarının varlığı ve küçük zengin gen-kromozom tercihli dernek olarak, genomik organizasyonu sayısız özellikleri ortaya koymaktadır. Korelasyon analizinde, insan genomunun iki bölmeye ayrılmış olduğunu gösteren iletişim matris uygulanabilir: kapalı, ulaşılmaz ve etkin kromatin bölgeleri içeren, açık, ulaşılabilir ve aktif kromatin ve daha yoğun bir bölmesi içeren daha az yoğun paketlenmiş bölmesi. Son olarak, teorik türevleri ve hesaplama simülasyonları ile birleştiğinde topluluğu iletişim matris analizi, Hi-C megabase ölçekte bir fraktal küreciğin konformasyon ile tutarlı özellikler gösterdiği saptandı.

Hi-C yöntemi kromatin etkileşimler (1) tarafsız, genom kimlik sağlar. Hi-C çiftler yakınlık ligasyonu ve güçlü paralel sıralama. Ortaya çıkan veriler farklı ölçeklerde genomik mimarlık eğitimi için kullanılabilir: ilk sonuçlar, kromozom toprakları, segregasyon, açık ve kapalı kromatin ve megabase ölçekte kromatin yapısı gibi özellikleri tespit.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Kromozomların üç boyutlu katlanması, genomu kompartmanlara ayırır ve promotörler ile enhancerlar gibi uzak fonksiyonel elementleri...

Hi.C, genom genelinde tarafsız bir biçimde uzun menzilli kromatin etkileşimlerinin belirlenmesi için kullanılan bir yöntemdir. İlk olarak hücreler formaldehit ile fikse edilir, ardından hücreler lizelenir ve DNA bir restriksiyon enzimi ile fragmanlara ayrılır. Sonrasında, beş prime çıkıntılar küt uçlu hale getirilip doldurulurken biyotillenmiş bir kalıntı dahil edilir ve çapraz bağlar ile DNA fragmanları arasındaki ligasyon olaylarını destekleyen seyreltik koşullar altında ligasyon gerçekleştirilir.Kütüphane parçalanır ve bağlantı noktaları strep havein boncuklar ile çöktürülür. Saflaştırılan bağlantı noktaları daha sonra yüksek kapasiteli bir dizileyici kullanılarak analiz edilebilir ve bu işlem, etkileşime giren fragmanların bir kataloğu ile sonuçlanır. Bu sonuçlar, kromozom bölgelerinin varlığını, genomun açık ve kapalı kromatin şeklinde kompartmanlara ayrılmasını ve megabase ölçeğindeki Fraktal Glo organizasyonuna dair kanıtları ortaya koyarak kromatin katlanması hakkında bize bilgiler sağlar.Merhaba, ben Massachusetts Tıp Fakültesi'ndeki gen fonksiyonu ve ekspresyonu programı bünyesindeki Field Decker Laboratuvarı'ndan Nka Van Bergham. Merhaba, ben Harvard ve Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'nün Broad Enstitüsü'ndeki Eric Lander laboratuvarından Ez Lieberman Aiden. Ben Broad Enstitüsü'ndeki moleküler biyoloji Ar-Ge grubundan Louis Williams ve son olarak Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'ndeki Len Muni laboratuvarından Maxima Mackay.Bugün size, High-C olarak adlandırılan genom çapında kromozom onaylama yakalama prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, insan genomunun mimarisini deneysel olarak araştırmak için kullanıyoruz. Size göstereceğimiz prosedürün ilk kısmı UMass Medical School'da gerçekleşecek ve ikinci kısmı Prude Institute'da yapılacaktır. Ayrıca, High-C deneyinin sonuçlarını MIT'de genom dinamiklerini simüle etmek için nasıl kullandığımızı da göstereceğiz.Öyleyse başlayalım. Haydi başlayalım. Hi-C, kromozom konformasyon yakalamada yaygın bir yöntem olan hücrelerin çapraz bağlanmasıyla başlar.Başlamak için, kültüre edilmiş veya süspansiyon halindeki 10⁷ ile 2,5 x 10⁷ arasında memeli hücresini çapraz bağlayın ve hücreleri bir homojenizatör kullanarak 550 µL lize tamponu içinde lize edin. Kromatini 5.000 RPM'de santrifüjleyin ve peleti 500 µL NEB tampon 2 ile iki kez yıkayın; ardından örneği beş adet numaralandırılmış tüpe paylaştırın ve toplam hacim 362 µL olacak şekilde NEB tampon 2 ekleyin.38 µL %1 SDS karışımını dikkatlice ekleyin ve 65 °C'de 10 dakika boyunca inkube edin. Tüpleri hemen tekrar buz üzerine yerleştirin ve 400 ünite Hind III ile dikkatlice karıştırılmış 44 µL Triton X 100 ekleyerek SDS'yi nötralize edin; ardından rotasyon eşliğinde 37 °C'de gece boyunca inkube edin. Sonraki adımlar Hi-C'ye özgüdür ve DNA uçlarının biyotinle işaretlenmesini ve çapraz bağlı fragmanların küt uç ligasyonunun gerçekleştirilmesini içerir.Bu adım, ligasyon eklemlerinin daha sonraki tüplerde saflaştırılmasına olanak sağlayacaktır. Bir tüp biotin elüsyonu adımına girmemeli, bunun yerine sindirim ve ligasyon koşullarının, kalan dört tüpteki restriksiyon fragmanı çıkıntılarını doldurmak ve DNA uçlarını biotin ile işaretlemek için optimal olduğunu doğrulamak amacıyla bir kontrol grubu olarak hizmet etmelidir. İki ila beş numaralı tüplere dATP, dGTP ve dTTP ekleyin.Ayrıca biotin ile ilişkilendirilmiş DCTP ve Klino ekleyin. Dikkatlice karıştırın ve 37 derece Celsius'ta 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından tüpleri buz üzerine yerleştirin, ardından enzimleri inaktive etmek için tüm tüplere 86 µL %10 SDS ekleyin.Tüpleri tam olarak 30 dakika boyunca 65 °C'de inkübe edin ve hemen ardından buz üzerine yerleştirin. Çapraz bağlanmış fragmanlar arasındaki ligasyon olaylarını desteklemek için ligasyon işlemi aşırı seyreltik koşullar altında gerçekleştirilir. Buz üzerinde çalışarak, beş adet 15 mL'lik tüpün her birine 7,61 mL ligasyon karışımı ekleyin.Ardından, sindirilmiş her bir kromatin karışımını ilgili tüpe aktarın. Standart bir 3C ligasyonu gerçekleştirmek için birinci tüpe 10 µL T4 DNA ligaz ekleyin. Daha sonra, küt uçlu high-C ligasyonu gerçekleştirmek için iki ile beş numaralı tüplere 50 µL T4 DNA ligaz ekleyin.Tüpleri altüst ederek karıştırın ve 16 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her tüpe 50 µL proteinaz K ekleyip tüpleri 65 °C'de gece boyunca inkübe ederek proteini degrade edin ve CNA çapraz bağlarını geri döndürün. Ertesi gün her tüpe 50 µL daha proteinaz K ekleyin ve 65 °C'de iki saat daha inkübe etmeye devam edin.Reaksiyon karışımlarını çağırın ve beş adet 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Bu tüplerdeki DNA'yı fenol ekstraksiyonu yaparak saflaştırın. 10 mililitre fenol ekleyin ve iki dakika boyunca vorteksleyin.Tüpleri 3.500 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve sulu fazın mümkün olduğunca çok kısmını dikkatlice yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın. Fenol kloroform kullanarak ekstraksiyonu tekrarlayın ve etanol kullanarak DNA'yı çöktürün; etanol ile çöktürülen DNA'nın santrifüj edilmesinden sonra her bir DNA peleti 450 µL 1X TE tamponu içerisinde çözülür ve 1,7 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarılır. 500 µL fenol kloroform ile iki kez fenol kloroform ekstraksiyonu yapılarak yeni bir saflaştırma aşaması gerçekleştirilir; bir dakika boyunca vortekslenir, tüpler 14.000 RPM'de beş dakika santrifüj edilir ve ikinci ekstraksiyondan sonra sulu faz yeni bir tüpe aktarılır.Çöktürülmüş DNA santrifüjle dibe çöktürüldükten sonra DNA, etanol ile çöktürülür; her bir DNA peleti bir kez %70 etanol ile yıkanır ve ardından 25 µL 1X tampon çözelti içinde yeniden süspanse edilir. Her tüpe 1 µL RNase ekleyip tüpleri 37 °C'de 30 dakika inkübe ederek mevcut olabilecek tüm RNA'ları degrade edin. Birinci tüpü 3C kontrolü olarak ayrı tutarak, iki ila beş arasındaki tüplerin yüksek C içeriklerini hazırlayın.Şimdi, 0,8% AASE jelinde bir alikot çalıştırarak kütüphanelerin miktarını ve kalitesini incelemek için uygun bir zamandır; HI C ligasyon verimliliği bir PCR digest analizi ile değerlendirilmelidir. HI C prosedüründe gerçekleştirilen künt uç oluşturma ve ligasyon, NHE 1 endonükleazı için restriksiyon bölgeleri oluşturacaktır; üç C ve high C kütüphanelerinden amplifiye edilen fragmanlar, künt uçların ne kadar iyi oluşturulduğunu belirlemek için Hind III ve NHE 1 ile digeste edilebilir ve bazı fragmanlar ligasyona uğramamış olacaktır. Yazılı protokolde açıklandığı üzere, T 4 DNA polimerazın ekzonükleaz aktivitesini kullanarak bu ligasyona uğramamış uçlardaki biyotini uzaklaştırın.DNA'yı fenol kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürme yöntemlerini kullanarak tekrar saflaştırın ve DNA peletlerini toplam 100 microliters su içerisinde yeniden süspande edin. Numune kalite kontrol analizlerinden geçtiyse, protokol bio timple down ve sekanslama ile devam eder. Teşekkür ederiz.BİYOTİNLEK DNA'yı yüksek verimli dizilemeye uygun hale getirmek için, DNA bir CAVAS S two cihazı ile 300 ila 500 baz çifti boyutuna getirilmelidir. DNA'lar; 10 x lation tamponu, DN TPS T four DNA polimeraz, T four POLYNUCLEOTIDE kinaz, clear now DNA polimeraz ve su eklenerek onarılır. Örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, üretici önerilerine uygun olarak DNA'yı saflaştırmak için bir Kaya Gym MinLu kolonu kullanın. DNA'yı kolona yükleyip kolonu yıkadıktan sonra, DNA'yı 50 µL bir XTLE tamponu ile iki kez elüye edin, ardından 10 XNEB tamponu, iki DATP, su ve ekzonükleaz eksik cile fragment ekleyerek uçları onarılmış DNA'nın üç primerinine DATP'yi tutturun.Cile fragmanını inaktive etmek için reaksiyonu 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Reaksiyonları 65 °C'de 20 dakika inkübe edin ve ardından hızla vakumlayan bir santrifüj (speed vac) kullanarak reaksiyonları buz üzerinde soğutun, reaksiyon hacimlerini 20 µL'ye düşürün. Ardından, DNA'yı 1X TAE içeren %1,5'luk Agaroz jeline yükleyin ve 80 ila 90 V'da 3,5 saat boyunca yürütün.300 ile 500 baz çifti arasındaki DNA fragmanlarını kesin ve jel ağırlığına bağlı olarak iki ila dört kolon kullanarak bir Qiagen jel ekstraksiyon kiti ile saflaştırın. Kayak hızlı kolonlardan gelen sarı elüatları birleştirin ve 1X TE tamponu ile son hacmi 300 µL'ye tamamlayın. Son olarak, Qubit kullanarak QU analizi ile DNA konsantrasyonunu belirleyin ve protokolün bu bölümündeki toplam DNA miktarını hesaplayın.Ligasyon eklem yerleri DNA havuzundan saflaştırılarak, çift uçlu sekanslama ile etkileşen kromatin fragmanlarının verimli bir şekilde tanımlanması sağlanır. Sonraki tüm adımları DNA düşük bağlanma özellikli tüplerde gerçekleştirin. Boncukları biyotin için hazırlayın.Resüspande edilmiş 150 µL manyetik strep A yüklü boncuğu, 400 µL 1x tween tamponu ile iki kez yıkayarak çöktürme işlemi gerçekleştirin. Bundan sonraki yıkama işlemleri şu beş adımdan oluşur: boncuklara tampon eklemek, karışımı yeni bir tüpe aktarmak, örneği oda sıcaklığında üç dakika boyunca döndürmek ve boncukları manyetik partikül konsantratörü kullanarak geri kazanmak.Süpernatantı uzaklaştırıyorum. Boncukları 300 µL 2x Tween içermeyen tamponla yıkayın ve 300 µL yüksek cDNA ile birleştirin. Karışımı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca rotasyonla inkübe ederek, biyotin işaretli yüksek cDNA'nın strep-din boncuklarına bağlanmasını sağlayın.Boncuklara bağlı DNA bağlanan strp A'yı bir manyetik partikül konsantratörü ile geri kazanın ve süpernatantı uzaklaştırın. Boncukları 400 µL 1x no tween tamponu ile, ardından 100 µL 1x ligasyon tamponu ile yıkayın. Boncukları 50 µL 1x ligasyon tamponunda yeniden süspande edin ve karışımı yeni bir tüpe aktarın.DNA'yı Illumina paired-end dizileme için hazırlamak amacıyla, daha önce quant testi kullanılarak hesaplanan ve biotin çöktürme için kullanılan toplam DNA giriş miktarını alın ve ligasyon için mevcut olan çöktürülmüş yüksek miktarlı cDNA miktarını tahmin etmek için bu değeri 20'ye bölün. Ligasyon için mevcut olan her mikrogram yüksek miktarlı cDNA başına altı pmol Illumina paired-end adaptörü ekleyin. Adaptörleri DNA'ya ligasyonla bağlamak için 1.200 ünite T4 DNA ligaz kullanın.Oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Yüksek cDNA bağlı boncukları geri kazanarak ve boncukları 400 µL 1x tween tamponu ile iki kez yıkayarak ligasyon gerçekleşmemiş çift uçlu adaptörleri uzaklaştırın. Boncukları 200 µL 1x tween içermeyen tamponla, ardından 200 µL ve sonra 50 µL 1X NEB tamponu ile yıkayın.Son yıkamadan sonra iki kez tekrarlayın. Boncukları 50 µL NEB buffer 2 içerisinde yeniden süspand edin ve yeni bir tüpe aktarın. Sekanslama için yeterli PCR ürününü üretmek amacıyla gerekli döngü sayısını belirlemek içindir.6, 9, 12 veya 15 döngülü dört adet test PCR reaksiyonu hazırlayın. PCR reaksiyonlarını %5'lik poliakrilamid jel üzerinde çalıştırarak ve Cyber Green ile boyayarak; sahte bantların yokluğunu ve adaptörlerle ligasyon sonrası ortak ürünlerin uzunluğu olan 400-600 baz çifti arasında bir yayılmanın (smear) varlığını doğrulayarak optimal döngü sayısını belirleyin. Yüksek C kütüphanesi turunun geri kalanını, boncuklar içindeyken optimal PCR döngü sayısı ile büyük ölçekli bir PCR ile amplifiye edin. PCR ürünlerini ayrı kuyucuklardan çekin ve boncukları geri kazanın.Büyük ölçekli PCR ürünlerinin %1'ini jel üzerinde çalıştırmak için ayrı tutun ve PCR ürününün geri kalanını, üretici önerilerine göre 1,8 kat hacimde saf boncuklar (beads) kullanarak saflaştırın. DNA'yı 50 µL 1X TE tamponu ile elüe edin ve PU boncuklarla saflaştırılmış PCR ürününün %1'ini, orijinal PCR ürününün %1'lik alikotuyla %5'lik poliakrilamid jel üzerinde karşılaştırın. PCR primer dizilerinin başarıyla uzaklaştırıldığından emin olarak, Illumina paired-end dizileme ile yüksek C kütüphanesinin her bir ucunu, etkileşimli kromatin fragmanlarını tanımlamak için MAC kullanarak bağımsız olarak hizalayın.Yüksek C protokolü teknik olarak başarılı bir şekilde uygulandığında aşağıdaki sonuçlar beklenir ve bunlar kalite kontrol standartları olarak kabul edilebilir. Kalite kontrol adımları, hem üç C hem de yüksek C kütüphanelerinin 10 kilo bazdan daha büyük, oldukça belirgin bantlar şeklinde çalıştığını göstermelidir. DNA yayılması (smear), düşük ligasyon verimliliğine işaret eder.Genellikle, yüksek C kütüphanesinde ligasyon verimliliği, üç C şablonuna kıyasla biraz daha düşüktür. Yüksek C işaretlemesi ve ligasyon verimliliği, bir üç C PCR ürününün sindirimi ile tahmin edilebilir. Üç C eklemleri Hindi III ile kesilirken NHE I ile kesilmez.Yüksek C eklemleri için durum bunun tersidir. Bu PCR sindirim testi, yüksek C amplikonlarının %70'inin NHE one tarafından kesildiğini ve HI Hindi tarafından kesilmediğini göstermektedir. Üç. Ligasyon eklemlerinin etkili şekilde işaretlendiğini doğrulamak için, sıralanmış okumaların analizi, mavi ve kırmızı çizgilerle belirtilen hem kromozom içi hem de kromozomlar arası etkileşimlerden gelen okumaların, yeşil renkle gösterilen rastgele üretilmiş okumalara kıyasla Hindi üç restriksiyon bölgelerine anlamlı derecede daha yakın hizalandığını göstermelidir.Başarılı bir deneyde, hizalanabilir ok çiftlerinin %55'i kromozomlar arası etkileşimleri temsil eder. %15'i, aralarında 20 kilobazdan daha az mesafe olan fragmanlar arasındaki kromozom içi etkileşimleri temsil eder ve %30'u, aralarında 20 kilobazdan fazla mesafe olan kromozom içi ok çiftleridir. Bu dağılım, yüksek kapasiteli sekanslama öncesinde bir kalite kontrol biçimi olarak örneklenebilir.Yaklaşık 100 klonun klonlanması ve Sanger dizilemesi genellikle yeterlidir. Kromatin etkileşimleri, x ve Y eksenlerinin düşük çözünürlüklü genomik düzeni temsil ettiği ve her bir pikselin bunlar arasında gözlemlenen etkileşim sayısını temsil ettiği bir ısı haritası olarak görselleştirilebilir. Tipik olarak, doğrusal genomda birbirine çok yakın olan DNA fragmanları, birbirleriyle sıkça etkileşime girme eğilimindedir.Bu durum, intra kromozom haritalarında veya ısı haritalarında belirgin bir diyagonal olarak görülür. Aşağıdaki sonuçlar, genom organizasyonunun çeşitli seviyelerini ortaya çıkarmak için verilerin analiz edilmesinin farklı yollarını göstermektedir. Temas olasılığının genomik mesafeye karşı grafiğe dökülmesi, temas olasılığının genomik mesafenin bir fonksiyonu olarak azaldığını ve sonunda her mesafede bir platoya ulaştığını göstermektedir.Düz çizgiyle gösterilen kromozom içi etkileşimler, kesikli çizgilerle temsil edilen kromozomlar arası etkileşimlere göre daha zengindir. Bu durum, doğrudan kromozom bölgelerinin varlığına işaret eder; tüm kromozom çiftleri arasındaki gözlemlenen ve beklenen kromozomlar arası etkileşim sayılarının hesaplanması, belirli kromozom çiftleri arasında tercihli bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Parlak kırmızı renkle belirtildiği üzere, gen açısından zengin olan küçük kromozomlar öncelikle birbirleriyle etkileşime girmektedir.Bireysel kromozomlar da incelenebilir. Ham ısı haritası, lokus çiftleri arasındaki genomik mesafeyi hesaba katmak için beklenen bir ısı haritası kullanılarak ayarlanabilir ve böylece gözlemlenen/beklenen ısı haritası elde edilir. Ardından, gözlemlenen/beklenen ısı haritalarının satır ve sütunları ilişkilendirilerek bir korelasyon matrisi oluşturulabilir.Korelasyon analizi kullanılarak, insan genomunun iki kompartımana ayrıldığı kanıtlanmıştır. Bu durum, dama tahtası deseniyle gösterilmiştir. Yüksek C verilerinin kullanıldığı korelasyon ısı haritaları sayesinde, megabase ölçeğindeki kromatin katlanması hakkında yeni bilgiler edinilmiştir.Kromatin paketlemesinin sıradan bir polimer modeli, kromatinin bir denge GLO şeklinde paketlendiğini öne sürerdi. Temas olasılığının uzaklığın bir fonksiyonu olduğunu gösteren grafik, temas olasılığının genomik uzaklıkla yaklaşık eksi bir eğimli bir kuvvet yasasına göre ölçeklendiğini göstermektedir. Bu durum, denge GLO davranışı ile tutarlı değildir; ancak fraktal glo olarak bilinen alternatif bir yapı için beklentilerle örtüşmektedir. Burada iki dairesel yapı gösterilmiştir.Renklendirme, maviden siyan yeşile, sarıya, turuncuya ve kırmızıya doğru uzanan bir uçtan uzaklığa karşılık gelir. Denge kürecikleri gibi, fraktal kürecikler de fraktal Glo'da dolaşıklıklara sahip değildir. Kontur boyunca birbirine yakın olan lokuslar 3D'de de yakın olma eğilimindedir ve bu da monokromatik blokların oluşmasına yol açar.Bu tür bloklar denge durumundaki Glo'da bulunmaz. Dolanıklıkların eksikliği, globülleri kısıtlayan kuvvetin kaldırılmasıyla da gösterilebilir; globüllerin genişlemesine izin verildiğinde, fraktal glo hızla geri yoğunlaşmamış hale gelir (decondense). Buna karşılık, denge durumundaki Glo, çok fazla düğümlenmiş olduğu için bunu yapmaz.Sizlere bir analizör yüksek C kütüphanesi oluşturmayı yeni gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, verimli yüksek C ligasyonu ve saflaştırmasını sağlamak için uygun kontrollerin yapılmasını hatırlamak önemlidir. Okuma sayısı, etkileşim haritalarının çözünürlüğünü nihai olarak belirleyecektir.İnsan genomunun etkileşim haritalarını yaklaşık bir megabaz çözünürlükte oluşturmak için yaklaşık 30 milyon okuma kullandık. Çözünürlüğü N kat artırmak için, okuma sayısının n karenin katı kadar artırılması gerekir. İnsan genomunun yapısı hakkında bilgi edinmekten keyif almanızı umuyorum.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

hi-c-a-method-to-study-the-three-dimensional-architecture-of-genomes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

3DNA yazılım paketi, analiz inşa ve üç boyutlu nükleik asit yapıları görselleştirmek için yetenekleri ile popüler ve çok yönlü biyoinformatik bir araçtır. Bu makale bireysel yapıları ve ilgili yapıların toplulukları hem de uygulanabilir 3DNA mevcut yeni ve popüler özellikler, bir alt kümesi için ayrıntılı protokoller sunar.

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

3D çok renkli DNA FISH, 3B korunmuş çekirdekler içinde birden fazla genomik loci görselleştirmek için bir araç temsil eder, kesin olarak tek bir hücre düzeyinde nükleer alan içinde karşılıklı etkileşimleri ve lokalizasyon tanımlayan. Burada, adım protokol bir adım insan birincil hücrelerin geniş bir yelpazede için açıklanmıştır.

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

Hi-C 3.0, sinyal-gürültü oranını ve kromatin etkileşimi algılamasının çözünürlüğünü artırmak için formaldehit ve dissüksinimidil glutarat çapraz bağlayıcılarını DpnII ve DdeI kısıtlama enzimlerinin bir kokteyli ile birleştiren geliştirilmiş bir Hi-C protokolüdür.

Uzunluk Ölçekleri Arasında Kromozom Konformasyonunu Yakalama

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Genom çapında kromozom konformasyon yakalama yöntemi Micro-C-XL kullanılarak üç boyutlu genom organizasyonunu nükleozom çözünürlüğü ile haritalamak için bir protokol burada sunulmaktadır.

Memeli 3D Genom Etkileşimlerinin Micro-C-XL ile Haritalanması

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Gen ekspresyonu, gen promotörlerinin distal düzenleyici elementlerle etkileşimleri ile düzenlenir. Burada, düşük girişli Capture Hi-C'nin (liCHi-C) daha önce ölçülemeyen nadir hücre tiplerinde bu etkileşimlerin tanımlanmasına ne kadar izin verdiğini açıklıyoruz.

Kıt hücre popülasyonlarında promotör merkezli uzaysal-zamansal genom mimarisini incelemek için entegre bir iş akışı

Burada, RNA ile ilişkili kromatin DNA-DNA etkileşimlerini yakalamak için RNA ile ilişkili üç boyutlu genom organizasyonunu haritalamak için bir protokol sunuyoruz.

RNA ile İlgili Kromatin DNA-DNA Etkileşim Yöntemi

Öğrenin, Hi-C yöntemiyle kromatin etkileşimlerini ve genomun üç boyutlu mimarisini nasıl haritalandıracağınızı. Bu teknik, kromozom bölgeleri ve ölçekli kromatin yapısı hakkında kapsamlı bilgiler sunar.

Hi-C: genomların Üç boyutlu Mimari Eğitim Bir Yöntem.

Daha fazla video keşfet