Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Bu videoda, fibroblast büyüme faktörünün küçük molekül tabanlı modülasyonunu değerlendirmek için görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama yapılmıştır Rasm harita kinaz yolağı Zebra balığı embriyolarında transgenik erkek ve vahşi tip dişi zebra balığı bir üreme kafesinde çiftleştirilir. Döllenmiş yumurtalar dibe düşer ve toplanır ve bir Petri kabına aktarılır. Embriyolar gece boyunca inkübe edilir, daha sonra 96 oyuklu yuvarlak bir alt plakanın ayrı oyuklarına yerleştirilir.

Küçük molekül BCI, FGF sinyalini hiper aktive etmek için eklenir ve plaka altı saat boyunca inkübe edilir. Her bir iradeden alınan görüntüler, bir konfokal plaka okuyucu ile yakalanır ve belirli embriyonik yapılardaki floresan yoğunluklarını bildiren kendi tasarladığı bir algoritma kullanılarak analiz edilir. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Mikrobiyoloji ve Moleküler Genetik Bölümü'nden Dr.Michael Chang'ın laboratuvarından Hiba Kado.

Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi İlaç Keşif Enstitüsü'nden Andrea Spock. Bugün size kimyasal işlem için zebra balığı embriyolarının yetiştirilmesi, seçilmesi ve dizilmesi prosedürünü göstereceğiz. 96 oyuklu bir plakada, fiberglas büyüme faktörü aktivitelerini rapor eden ve bu geçmiş beyazı hiper aktive eden bir molekül ile tedavi edilen transgenik embriyoları kullanacağız.

Transgenik zebra balığı embriyolarında fibroblast büyüme faktörü aktivitesini otomatik olarak elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için yüksek içerikli tarama metodolojisini nasıl kullandığımızı size göstereceğiz. Bu prosedür, transgenik zebra balığı ve yüksek verimli kimyasal ekranları kullanmak için platform teknolojisini vurgulayacaktır. Öyleyse başlayalım.

Tedaviden iki gün önce, homozigot erkek transgenik zebra balığını tanımlayın ve bunları ayrı çiftleşme tanklarına yerleştirin. Tanklara ayırıcılar ekleyin, ardından her tanka vahşi tip bir dişi balık ekleyin ve balıkları gece boyunca 28 santigrat derecede çiftleşme kafeslerinde bırakın. Ertesi sabah, ayırıcıyı çıkarın Bir saat sonra, balığı yeni bir tanka taşıyın ve embriyoları plastik bir elek içine dökün.

Embriyoları E üç solüsyonu ile 100 milimetrelik tabaklara aktarın ve altı ila sekiz saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra embriyoları stereo mikroskop altında inceleyin. Deneyler için uygun olan embriyolar gaz işlemine tabi tutulacaktır.

Bu sırada, tek hücre aşamasında kalacak olan döllenmemiş embriyoları çıkarın. Ayrıca, opak veya kusurlu görünen canlı olmayan embriyoları çıkarın. Daha sonra taze E üç çözeltisi ekleyin ve gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, transgenik embriyoları benzer aşama ve üniform için sıralamak için embriyoları bir floresan stereo mikroskop altına yerleştirin. GFP ekspresyonu 24 HPF embriyoları, yoğun GFP ekspresyonu ile görünür bir orta arka beyin sınırı ve GFP pozitif dorsal retinaları olan iyi şekillendirilmiş gözler gösterir. Bu embriyolar aktiftir ve plastik bir mera pipeti kullanarak corion'larında hareket eder ve kıpırdar.

24 HPF embriyosunu birer birer 96 oyuklu bir plakanın ayrı ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir mikro pipet kullanarak, oyuklardaki fazla E üç çözeltisini çıkarın. Daha sonra çok kanallı bir pipetleyici kullanarak, her bir oyuğa 200 mikrolitre E üç solüsyonu ekleyin.

Daha sonra, birinci ve 12 sütunlarındaki tüm kuyucuklara iki mikrolitre DMSO ekleyin. Daha sonra DMSO'da hazırlanan iki mikrolitre BCL'yi aşağıdaki gibi, bir, mikromolar olarak iki ve yedinci sütunlara ekleyin. Beş mikromolar ila üç ve sekiz, 10 mikromolar ila dört ve dokuz 20.

Beşinci ve 10. sütunlara mikromolar. Ve son olarak, altıncı ve 11. sütuna 25 mikromolar. Şimdi plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 28 santigrat derecede altı saat inkübe edin.

30 HPF embriyosunu uyuşturmak için her oyuğa 10 mikrolitre trica ekleyin. Ardından plakayı moleküler cihazlara yükleyin image express ultra açık meta express yazılımı. Forex objektifi ve maksimum iğne deliği çapı olan bir konfigürasyon seçin.

Plaka tabanını algılamak için lazer otomatik odaklamayı yapılandırın ve önceden belirlenmiş bir optimum Z ofseti kullanın. İlgilenilen bölgeleri tespit etmek için, tarama alanını 2000 x 2000 piksellik tek bir site olarak ayarlayın. 525 nanometre üzerinde 488 emisyon dalga boyları üzerinde uyarmada uygun plaka tipini ve 488 nanometre argon lazeri seçin.

Ardından, araçla tedavi edilmiş bir embriyo içeren bir kuyu seçin ve örnek bul'a tıklayın. Cihaz, otomatik odaklama taraması gerçekleştirecek ve uygun görüntü alımını doğrulamak için tek bir görüntü elde edecektir. İyi muamele görmüş bir aracı rastgele seçin ve bir görüntü elde edin.

Görüntü odaktaysa ve kafada GFP ifadesi gösteriyorsa. İmleci en parlak alanların üzerine getirin ve floresan yoğunluğunun 16 bit kameranın menzili içinde olduğunu doğrulayın. 65.000 birimden az.

Bu adımları başka bir araç kontrolü ve birkaç bileşik işlem görmüş kuyu ile tekrarlayın. Gerekirse, lazer gücünü ayarlayın ve pozitif kontrol görüntülerindeki en parlak bölgeler doygun hale gelmeyecek şekilde kazanç elde edin. Ardından, plaka alma ve kontrol penceresinde, plaka taramasını başlatmak için plaka al'ı seçin.

Cihaz, tüm mikroplaka için kuyu başına otomatik olarak bir görüntü alacak ve bunları bir SQL sunucu veritabanında arşivleyecektir. Tarama bittiğinde, görüntüleri D tanımına yükleyin. Geliştirici, geliştiriciyi sapancı seçeneği etkinken açarak.

Yeni bir çalışma alanı oluşturun. Ardından dosya menüsünden özelleştirilmiş içe aktarma'yı seçin. Ardından, görüntüleri içeren klasöre gidin ve örnek bir dosya açın.

Moleküler cihazlar image express ultra platformu tarafından oluşturulan görüntü biçimini ve dosya yapısını tanıyan bir içe aktarma filtresi seçin. Şimdi görüntüleri işlemek için bir kontrol görüntüsü açın ve istenen biliş ağı teknolojisini veya CNT algoritmasını veya kural setini yükleyin. Burada kullanılan özel algoritma, embriyo, yumurta sarısı ve kafayı otomatik olarak tanımlamak ve GFP'yi ifade eden kafa yapılarının parlaklığını ve alanını ölçmek, kafa ve yumurta sarısı algılama aşamasına ayarlanan kuralı uygulamak için tasarlanmıştır.

Yumurta sarısı torbasının ve başının uygun şekilde atanmasını sağlamak için, yumurta sarısı çok büyük veya çok küçükse yumurta sarısı algılama eşiğini ayarlamak için kural setini değiştirin. Ardından, parlak kafa yapılarının algılanması aşamasına ayarlanan kuralı uygulayın. Kafadaki GFP ifade eden alanların uygun şekilde atanmasını sağlamak için, parlak kafa yapılarının tespiti görsel gözlemle eşleşene kadar kafa yapıları algılama eşiğini önemsiz yoğunluğun katları olarak ayarlamak için kural setini değiştirin.

Ardından, tüm kural setini, araçla tedavi edilen embriyolardan oluşturulan rastgele seçilmiş birkaç görüntü ve PCI ile tedavi edilen embriyolardan elde edilen pozitif kontrol görüntüleri üzerinde manuel olarak uygulayın. Algoritmayı tüm plaka görüntülerinde çalıştırmak için, analiz edilecek plakaları seçin ve seçin. Analiz edin, ardından optimize edilmiş kural setine gidin ve tüm kuyuları analiz edin.

Entegre iş zamanlayıcı kullanılarak, boş kuyular veya belirsiz görüntüler tarama sırasında otomatik olarak analizden çıkarılacaktır. Sürekli güncellenen bir tutma haritası gösterilir. Görsel inceleme için çalışma sırasında hem verilere hem de görüntülere erişilebilir.

Sayısal veriler ve işlenen görüntüler otomatik olarak kaydedilir. Tüm görüntüler analiz edildikten sonra, veriler Excel, GraphPad veya prizma gibi üçüncü taraf yazılımlara aktarılabilir. Bu şekil, CNT analizi ile ve CNT analizi olmadan iyi muamele edilen bir araçtan ve A BCI'den arşivlenmiş tarama görüntülerini göstermektedir.

Uygulanan yeşil floresan proteini veya GFP, transgenik embriyoların göz, orta arka beyin sınırı ve trigeminal gangliyonlarında tespit edilir. Hem GFP yoğunluğunun hem de ifade alanlarının genişletildiğini unutmayın. Buradaki BCI ile tedavi edilen embriyolarda, BCI'nin transgenik embriyolarda GFP raportör gen ekspresyonu üzerinde doza bağlı bir etkisi görülmektedir.

Yarım maksimal yanıt veya EC 50 ortaya çıkarmak için gereken konsantrasyon yaklaşık 12 mikromolar idi. Size transgenik zebra balığı embriyolarını nasıl yetiştireceğinizi, toplayacağınızı ve 96 kuyucuklu plakaya nasıl yerleştireceğinizi gösterdik. Sinyal yolunun kendi aktivatörüne artan PCI konsantrasyonu ekledik.

Ayrıca transgenik embriyoların görüntülenmesinin nasıl otomatikleştirileceğini gösterdik ve görüntüleri biliş ağı teknolojisine dayalı özel olarak tasarlanmış bir algoritma ile analiz ettik. Bu yaklaşımla, fibroblast büyüme faktörü sinyallemesinin küçük moleküllü bir aktivatörünün etkilerini kademeli bir şekilde kantitatif olarak ölçebildik. Bu prosedürü yaparken, örnekler arasındaki değişkenliği en aza indirmek için embriyoları dikkatlice seçmeyi unutmamak önemlidir.

Bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.