Name: Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Keşfedin otomatik görüntüleme ve analiz yöntemini kullanarak zebrafish transgenik embriyolarında yüksek verimli kimyasal tarama. BCI molekülünün FGF sinyal yolağı üzerindeki doza bağımlı etkilerini ölçün ve geliştirme biyolojisi araştırmalarını hızlandırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Hukriede, NCI / NIH (P01 CA78039) Vogt ve NHLBI / NIH (1R01HL088016) Tsang için NICHD / NIH (1R01HD053287) tarafından finanse edilmektedir.

1) Zebra balığı çiftleşmelerin ve BCI tedavi ayarlayın. <ol><li> Bireysel çiftleşme tankları 1'e pt6 Zebra balığı ve yeri: İki gün önce tedavi, homozigot erkek Tg (d2eGFP dusp6) tanımlamak. Ayırıcı ve vahşi bir türü AB * dişi balık ekleyin ve çiftleşme kafesleri bir gecede terk. </li><li> Ertesi sabah ayırıcı kaldırmak ve 1 saat sonra embriyolar toplamak. E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4), çözüm ve 6 saat boyunca 28 ° C'de inkübe 100mm yemekleri embriyo transferi. Ölü kaldırın ve gübresiz embriyolar, taze E3 bir çözüm ekleyin ve bir gece inkübe edin. </li><li> Benzer evre (24hpf) ve uniform GFP ifade transgenik embriyolar sıralayın. 96 plaka her kuyuya ayrı ayrı Dizi embriyolar. </li><li> Mikropipet aşırı E3 çözüm çıkarın. E3 çözüm her kuyuya bir çok kanallı pipet ile 200μl ekleyin. </li><li> Olarak listelenen aşağıdaki bileşikler ekle: <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> A </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> B </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> C </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> D </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> E </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> F </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> G </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2,5 mM) </td><td> 2μl DMSO </td></tr><tr><td> H </td><td> 2μl DMSO </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl BCL (0.1mm) </td><td> 2μl BCL (0.5mm) </td><td> 2μl BCL (1mm) </td><td> 2μl BCL (2mm) </td><td> 2μl BCL (2.5mm) </td><td> 2μl DMSO </td></tr></tbody></table> Final konsantrasyonları, 1% DMSO 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI 1 mikrona kadar. Kapak ve alüminyum folyo levha az 6 saat boyunca inkübe 28 ° C </li></ol> 2) 96-kuyucuğu ve analiz Otomatik görüntüleme. <ol><li> 30hpf embriyolar uyutmak için her iyi tricaine (0.61mM) 10μl ekleyin. </li><li> Moleküler Cihazlar Imagexpress Ultra içine plaka yükleyin. </li><li> Açık Metaxpress yazılım. 4x amacı ve maksimum iğne deliği çapı ile bir yapılandırma seçin, lazer otofokus plaka alt algılamak için yapılandırmak ve Z-düzleminde ilgi bölgeleri tespit etmek için en iyi belirlemek. 488 / 525 nm (GFP) uyarma / emisyon dalga boylarında görüntüler elde. Hiçbir binning ile 2000x2000 piksel (4 x 4 mm), tek bir site olarak alan tarama ayarlayın. Lazer güç yapılandırma ve pozitif kontrol görüntüler gibi parlak bölgelerde elde doyurabilecek değil. Birçok pozitif ve negatif kontrol kuyuları düzgün bir görüntü elde etme onaylayın. </li><li> Plaka tarama başlatın. Cihaz, otomatik olarak tüm kuyuları ve arşiv onları bir SQL Server veritabanı görüntüleri kazanacaklardır. </li><li> Definiens Geliştirici Cellenger uygulama modülü ve Moleküler Aygıtlar Imagexpress Ultra platformu tarafından oluşturulan görüntü formatı ve dosya yapısını tanıyan bir ithalat filtre kullanarak resim gönderin. </li><li> Özel olarak tasarlanmış bir Biliş Ağ Teknolojisi algoritma (aynı zamanda bir kural setleri olarak adlandırılır) ile işlem görüntüler. Biz özel kısa bir süre önce yayınlanan kuralkümesi 2 dayalı geliştirilen algoritma, embriyo, yumurta sarısı, ve baş otomatik olarak tespit etmek ve kafa yapıları GFP-ifade parlaklık ve alanını ölçmek için tasarlanmıştır . Embriyo tespit edildiği veya kafası net bir şekilde atanan (örneğin, odak görüntüleri yüksek bileşik toksisite veya dışarı) olamaz nerede Wells analiz dışında tutulmuştur. Algoritma kullanarak birkaç negatif kontrol görüntüler (araç tedavi) ve pozitif kontrol görüntüler (BCI tedavi) baş ve yumurta sarısı, hem de doğru tanımlanmış olması gibi yapılandırın. Parlak kafa yapılarının tespiti görsel gözlem eşleşen kadar ortalama sarısı yoğunluğu katları olarak bir "kafa yapıları" algılama eşiği ayarlayın. Ihracat parametreleri tanımlayın. Bu örnekte, en bilgilendirici parametre bundan sonra "toplam kafa yapıları parlaklık" (Şekil 1) olarak adlandırılan başın içinde GFP pozitif bölgelerde, toplam entegre parlaklık oldu. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Grafik transgenik embriyolarda GFP ifade BCI doza bağımlı etkileri depicitng. </li><li> Algoritma kullanan tüm entegre iş scheduler plakası görüntüleri çalıştırın. Definiens yazılım aynı anda birden fazla görüntü analizi sağlayan dağıtılmış bilgi işlem, birkaç işlemci ("motorları") kullanır. Algoritması uygulanan analizi ile işlenmiş görüntünün bir kopyası ile birlikte veritabanına kaydedilir görüntü analizi, elde edilen sonuçlar dayalı sayısal ölçümler hesaplar. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Sonra tüm görüntüleri analiz, veri Cellenger içinde görüntülenir ya da daha fazla analiz ve grafiksel gösterimi için üçüncü parti yazılımlar (Excel, GraphPad Prism) ihraç. Şekil 2 tedavi edilen bir araç tarama görüntüler arşivlenir ve iyi uygulanmış ve CNT analiz olmadan BCI-tedavi bir. Şekil 1 belgeleri Tg GFP muhabiri gen ekspresyonu (dusp6: d2EGFP) BCI, doza bağımlı bir etkisi pt6 embriyolar. Yarım maksimum yanıt (EC50) ortaya çıkarmak için gerekli konsantrasyonu yaklaşık 12 mcM idi. <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Transgenik zebrafish embriyoların Otomatik görüntü yakalama ve analizi. 30hpf pt6 embriyo: (A) DMSO araç Tg (d2eGFP dusp6) tedavi. (B) 20μM BCI gösterisi ile tedavi edilen transgenik embriyolar GFP ifade artırır. (C) embriyo Görüntü (A) baş GFP ifade bulmak için kural setleri Definiens çalıştırdıktan sonra. Turuncu noktalar yazılım GFP yoğunluğunu ölçen göstermektedir. (D) embriyo Görüntü, (B) baş GFP ifade bulmak için kural setleri Definiens çalıştırdıktan sonra. Turuncu noktalar yazılım GFP yoğunluğunu ölçen göstermektedir. Kuralkümesi tedavi edilen embriyo GFP ifade genişletilmiş bir alan bulmak mümkün olduğunu unutmayın.

<ol><li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li>
<li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li>
</ol>

Zebrafish kimyasal ekranların verimini sınırlayan en önemli faktör, sistematik bir süreç görüntüleme ve analiz için 96-kuyucuğu metodoloji eksikliği. Çok hücreli organizmalarda görüntüleri karmaşık, düşük kontrast ve heterojen doğası nedeniyle, mevcut görüntü analizi algoritmaları organizma içinde özel yapıları tespit etmek ve ölçmek için başarısız olur. En yayımlanan zebrafish kimyasal ekranları bu nedenle işlem boyunca özverili personeli tarafından bireysel kuyuların gözle muayene içerir. Bu genellikle sayısal okuma üretim ve tam bir ekran görüntüleri ve veri arşivleme önler. Ayrıca, elle değerlendirme, yani görüntü tabanlı tarama, ekran performansı retrospektif analizler yapmak için tarama kampanyası (örneğin, toksisite ya da gelişimsel kusurlar) birincil odak fenotipik değişiklikleri incelemek ve çapraz yeteneği çok önemli avantajları ortadan kaldırır geçmiş veya gelecekteki ekranlar ile aynı bileşik kitaplığı kullanılarak referans tarama verileri. Bu yazıda, kullanıcının müdahalesine gerek kalmadan zebrafish embriyoların multiwell plakalar otomatik görüntüleme ve analiz için metodoloji vurgulayın. Biz 96 kuyucuğu pt6 embriyo ve Definiens Biliş Ağ Teknolojisi ki sayısal GFP dayalı bir görüntü analizi algoritması geliştirilen görüntü Tg (d2EGFP dusp6): konfokal okuyucu (Moleküler Aygıtlar, Sunnyvale, CA) tarama ImageXpress Ultra lazer otomatik görüntü yakalama transgenik embriyoların başkanları ifade. Yöntemi kademeli yanıtları teslim ve FGF sinyalizasyon küçük bir molekül aktivatör in vivo aktivite nicel. Zebrafish embriyoların 2, piyasada bulunan plaka okuyucuları çeşitli otomatik görüntü yakalama uygulamak mümkün olduğunu belgeleyen Epifloresans tabanlı ArrayScan II (Cellomics A.Ş., Pittsburgh, PA) ile benzer sonuçlar elde edildi . Çok hücreli organizma görüntüler otomatik olarak analiz etmek için metodoloji geliştirilmesi, insan bir gözlemci tarafından görsel skorlama için ihtiyaç ortadan nesil ve gelecek ekranları ile retrospektif analizi ve karşılaştırmalar için sayısal veri ve görüntü arşivleme etkin.

<table><tbody><tr><td>Trikain (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat.# A-5040</td><td></td></tr></tbody></table>

zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

Biz zebrafish embriyolar FGF / RAS / MAPK yolağı modüle küçük moleküller tanımlamak için görüntü tabanlı yüksek içerik tarama (HCS) metodolojisi uygulama göstermektedir. Zebra balığı embriyosu, in vivo yüksek içerikli kimyasal ekranlar için ideal bir sistem. 1 gün eski embriyo yaklaşık 1 mm çapında ve 96-kuyu plakalar, yüksek verim tarama için standart bir format içine kolayca dizilmiş olabilir. Gelişimin ilk gününde, embriyolar, böylece embriyogenez sırasında doku oluşumu görselleştirme sağlayan en önemli organların en şeffaf. Özellikle otomatik görüntü toplama ve analiz geliştirme zebrafish kimyasal ekranların tam otomasyon, ancak hala bir sorundur. Biz daha önce FGF aktivite kontrolü altında yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden transgenik muhabir hattı oluşturulmuş ve kimyasal ekranları kendi programını gösterdi<sup&gt; 1</sup&gt;. Yüksek verim tüm organizmanın ekranları için metodoloji kurmak için, biz 24-48 saat sonra döllenme (hpf) 96-kuyucuğu zebrafish embriyoların otomatik görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirdi<sup&gt; 2</sup&gt;. Bu video 24hpf multiwell tabak içine transgenik embriyolar arraying ilişkin usul vurgulayın ve küçük bir molekül (BCI) FGF sinyalizasyon hyperactivates ek<sup&gt; 3</sup&gt;. Plakalar tricaine Moleküler Aygıtlar ImageXpress Ultra lazer tarama konfokal HCS okuyucu otomatik görüntüleme önce larva uyutmak için ek takip 6 saat inkübe edilir. Görüntüler transgenik embriyoların başkanları GFP ifade algılamak ve ölçmek için geliştirilen bir Biliş Ağ Teknolojisi algoritması kullanılarak Definiens Developer yazılımı tarafından işlenir. Bu örnekte BCI tedavi edilen embriyolar GFP muhabiri gen ekspresyonu üzerine doza bağımlı etkileri ölçmek için algoritma yeteneği vurgulayın.

Biz zebrafish transgenik embriyolar multiwell plakaları otomatik olarak görüntüleme ve analiz için bir sistem geliştirme raporu. Fibroblast Büyüme Faktörü muhabiri gen ekspresyonu üzerine küçük bir molekül, BCI, doza bağımlı etkileri ölçmek ve yüksek verimli zebrafish kimyasal ekranlar kurulması için teknoloji yeteneğini göstermektedir.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

FGF/RAS/MAPK yolağını modüle edebilen küçük molekülleri belirlemek için görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama (HCS) metodolojisinin uygulamasını gösteriyoruz...

Bu videoda, zebrafish embriyolarında fibroblast büyüme faktörü Ras-MAPK kinaz yolunun küçük molekül tabanlı modülasyonunu değerlendirmek için görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama gerçekleştirilmektedir. Transgenik erkek ve yabani tip dişi zebrafishler bir üretim kafesinde çiftleştirilir. Döllenmiş yumurtalar dibe çöker, buradan toplanarak bir Petri kabına aktarılır. Embriyolar gece boyunca inkübe edilir ve ardından yuvarlak tabanlı 96 kuyucuklu bir plakadaki münferit kuyucuklara yerleştirilir.FGF sinyalini hiperaktive etmek için küçük molekül BCI eklenir ve plaka altı saat boyunca inkübe edilir. Her bir kuyucuktan konfokal plaka okuyucu ile görüntüler alınır ve belirli embriyonik yapılardaki floresan yoğunluklarını raporlayan, özel olarak tasarlanmış bir algoritma kullanılarak analiz edilir. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Mikrobiyoloji ve Moleküler Genetik Bölümü'nden Dr. Michael Chang laboratuvarından Hiba Kado.Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi İlaç Keşfi Enstitüsü'nden Andrea Spock. Bugün size, kimyasal işlem için zebra balığı embriyolarının üretilmesi, seçilmesi ve dizilmesi prosedürünü göstereceğiz. 96 kuyucuklu bir plakada, fibroblast büyüme faktörü aktivitelerini raporlayan transgenik embriyolar kullanacağız ve bu yolu hiperaktive eden bir molekül ile işlem yapacağız.Transgenik zebra balığı embriyolarında fibroblast büyüme faktörü aktivitesini otomatik olarak elde etme, analiz etme ve nicelendirmek için yüksek içerikli tarama metodolojisini nasıl kullandığımızı göstereceğiz. Bu prosedür, transgenik zebra balıklarını ve yüksek verimli kimyasal taramaları kullanmaya yönelik platform teknolojisini vurgulayacaktır. Öyleyse başlayalım.Tedaviden iki gün önce, homozigot erkek transgenik zebra balıklarını belirleyin ve onları ayrı çiftleşme tanklarına yerleştirin. Tanklara ayırıcılar ekleyin, ardından her tanka bir vahşi tip dişi balık ekleyin ve balıkları gece boyunca 28 °C'de çiftleşme kafeslerinde bırakın. Ertesi sabah, ayırıcıyı çıkarın. Bir saat sonra, balıkları yeni bir tanka taşıyın ve embriyoları plastik bir süzgece dökün.Embriyoları E3 çözeltisi içeren 100 milimetrelik kaplara aktarın ve 28 °C'de altı ila sekiz saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından embriyoları bir stereo mikroskop altında inceleyin. Deneyler için uygun olan embriyolar gastrülasyon aşamasında olacaktır.Bu aşamada, tek hücreli evrede kalan döllenmemiş embriyoları uzaklaştırın. Ayrıca, opak veya şekil bozukluğu görülen canlı olmayan embriyoları da temizleyin. Ardından taze E three solüsyonu ekleyin ve 28 °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, benzer evrede ve tekdüze GFP ekspresyonuna sahip transgenik embriyoları seçmek için embriyoları floresan stereo mikroskop altına yerleştirin. 24 HPF embriyoları, yoğun GFP ekspresyonu ile belirgin bir orta beyin-arka beyin sınırı ve GFP pozitif dorsal retinalara sahip iyi oluşmuş gözler gösterir. Bu embriyolar aktiftir; plastik bir pastör pipeti kullanıldığında korionları içinde hareket eder ve kıvranırlar.24 HPF embriyoları teker teker 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir mikropipet kullanarak, kuyucuklardaki fazla E three solüsyonunu uzaklaştırın. Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak her kuyucuğa 200 µL E three solüsyonu ekleyin.Ardından, birinci ve 12. sütunlardaki tüm kuyucuklara iki µL DMSO ekleyin. Sonra, DMSO içinde hazırlanmış BCL'yi şu şekilde ekleyin: ikinci ve yedinci sütunlara 1 µM, üçüncü ve sekizinci sütunlara 5 µM, dördüncü ve dokuzuncu sütunlara 10 µM ve onuncu ve on beşinci sütunlara 20 µM.Beşinci ve onuncu sütunlara mikromolar. Ve son olarak altıncı ve on birinci sütunlara 25 mikromolar ekleyin. Şimdi plakayı alüminyum folyo ile örtün ve 28 °C'de altı saat boyunca inkübe edin.30 HPF embriyolarını anestezi etmek için her bir kuyuya 10 µL trica ekleyin. Ardından plakayı molecular devices image express ultra open meta express yazılımına yükleyin. 4x objektifli ve maksimum pinhole çaplı bir konfigürasyon seçin.Plaka tabanını tespit etmek ve önceden belirlenmiş optimal Z ofsetini kullanmak için lazer otomatik odaklamasını yapılandırın. İlgi bölgelerini tespit etmek için tarama alanını, binning yapmadan 2000'e 2000 piksel boyutunda tek bir bölge olarak ayarlayın. Uygun plaka tipini ve 488 nanometre argon lazerini, 488 nanometre uyarım ve 525 nanometre emisyon dalga boyları için seçin.Ardından, vehikül ile işlem görmüş bir embriyo içeren bir kuyucuk seçin ve örnek bul (find sample) düğmesine tıklayın. Cihaz, bir otomatik odaklama taraması gerçekleştirecek ve görüntüleme işleminin uygun olduğunu onaylamak için tek bir görüntü alacaktır. Rastgele vehikül ile işlem görmüş bir kuyucuk seçin ve bir görüntü alın.Görüntü netse ve kafada GFP ekspresyonu görülüyorsa; imleci en parlak bölgelerin üzerine getirerek floresan yoğunluğunun 16 bit kameranın 65.000 birimden düşük olan değer aralığında olduğunu doğrulayın.Bu adımları başka bir araç kontrolü ve birkaç bileşik uygulanmış kuyucuk ile tekrarlayın. Gerekiyorsa, pozitif kontrol görüntülerindeki en parlak bölgelerin doygunluğa ulaşmaması için lazer gücünü ve kazancı (gain) ayarlayın. Ardından, plaka edinme ve kontrol penceresinde, plaka taramasını başlatmak için plaka edin seçeneğini (acquire plate) belirleyin.Cihaz, tüm mikroplaka için kuyuk başına bir görüntü otomatik olarak elde edecek ve bunları bir SQL sunucu veri tabanında arşivleyecektir. Tarama tamamlandığında, slinger seçeneği etkinleştirilmiş halde geliştiriciyi açarak görüntüleri D tanımındaki geliştiriciye yükleyin.Yeni bir çalışma alanı oluşturun. Ardından dosya menüsünden özelleştirilmiş içe aktarma seçeneğini seçin. Sonrasında görüntülerin bulunduğu klasöre gidin ve örnek bir dosyayı açın.Molecular Devices Image Express Ultra platformu tarafından oluşturulan görüntü formatını ve dosya yapısını tanıyan bir içe aktarma filtresi seçin. Görüntüleri işlemek için bir kontrol görüntüsü açın ve istenen bilişsel ağ teknolojisini (cognition network technology) veya CNT algoritmasını veya kural setini yükleyin. Burada kullanılan özel algoritma; embriyoyu, vitellusu ve başı otomatik olarak tanımlamak ve GFP eksprese eden baş yapılarının parlaklığını ve alanını nicelendirmek için tasarlanmıştır; kural setini baş ve vitellus tespit aşamasına kadar çalıştırın.Vitellüs kesesi ve başın doğru atanmasını sağlamak için, vitellüs çok büyük veya çok küçükse vitellüs tespit eşiğini ayarlamak üzere kural setini değiştirin. Ardından, kural setini parlak baş yapılarının tespit edildiği aşamaya kadar yürütün. Baştaki GFP eksprese eden bölgelerin doğru atanmasını sağlamak için, parlak baş yapılarının tespiti görsel gözlemlerle eşleşene kadar, baş yapıları tespit eşiğini ortalama yoğunluğun katları şeklinde ayarlayarak kural setini değiştirin.Ardından, araç kontrolü uygulanan embriyolardan oluşturulan rastgele seçilmiş birkaç görüntü ve PCI uygulanan embriyolardan elde edilen pozitif kontrol görüntüleri üzerinde tüm kural setini manuel olarak uygulayın. Algoritmayı tüm plaka görüntüleri üzerinde çalıştırmak için analiz edilecek plakaları seçin ve Analyze'i seçin, ardından optimize edilmiş kural setine gidin ve tüm kuyucukları analiz edin.Entegre iş zamanlayıcısı kullanılarak, boş kuyucuklar veya belirsiz görüntüler tarama sırasında analizden otomatik olarak hariç tutulacaktır. Sürekli güncellenen bir takip haritası gösterilir. Hem verilere hem de görüntülere, görsel inceleme için çalışma sırasında erişilebilir.Sayısal veriler ve işlenmiş görüntüler otomatik olarak kaydedilir. Tüm görüntüler analiz edildikten sonra, veriler Excel, GraphPad veya prism gibi üçüncü taraf yazılımlara aktarılabilir. Bu şekil, CNT analizli ve analizsiz, bir araç ile bir BCI ile işlem görmüş kuyucuklardan alınan arşivlenmiş tarama görüntülerini göstermektedir.Uygulanan yeşil floresan protein veya GFP, transgenik embriyoların gözünde, orta arka beyin sınırında ve trigeminal gangliyonlarında tespit edilir. Hem GFP yoğunluğunun hem de ekspresyon alanlarının genişlediğine dikkat edin. Buradaki BCI ile işlem görmüş embriyolarda, transgenik embriyolardaki GFP raporlayıcı gen ekspresyonu üzerinde BCI'nın doza bağlı bir etkisi görülmektedir.Yarı maksimal yanıt uyandırmak için gereken konsantrasyon veya EC 50 yaklaşık olarak 12 micromolar idi. Size transgenik zebra balığı embriyolarının nasıl üretileceğini, toplanacağını ve 96 kuyucuklu plakalara nasıl yerleştirileceğini göstermiş olduk. Sinyal yolunun kendi aktivatörüne artan konsantrasyonlarda PCI ekledik.Ayrıca, transgenik embriyoların görüntülemesinin nasıl otomatikleştirileceğini gösterdik ve görüntüleri, bilişsel ağ teknolojisine dayalı özel olarak tasarlanmış bir algoritma ile analiz ettik. Bu yaklaşımla, bir fibroblast büyüme faktörü sinyalizasyon küçük molekül aktivatörünün etkilerini kademeli bir şekilde nicel olarak ölçebildik. Bu prosedürü uygularken, örnekler arasındaki değişkenliği minimize etmek için embriyoların dikkatle seçilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

development-automated-imaging-analysis-for-zebrafish-chemical

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı güçlü olarak ortaya...

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Bu makalede, zebra balığı embriyoları kimyasal toksisite taraması için kullanılmıştır. Kimyasal toksisite, fenotip okumaları ile ilişkilidir. Numune protokolü, kimyasal toksisite taramasının gerçekleştirilmesine yönelik metodolojik bir yaklaşımı göstermektedir.

Embriyo Bazlı Kimyasal Toksisite Ekranı: Zebra Balığı Embriyolarının Geliştirilmesi Üzerindeki Etkilerin Değerlendirilmesi

Zebra balığı larvalarını kullanarak glukokortikoid stres hormonu sinyali için bir kimyasal tarama sisteminin prosedürünü ve veri analizini açıklıyoruz: Glukokortikoid Duyarlı İn vivo Zebra Balığı Luciferaz Aktivitesi (GRIZLY) testi. Test, metabolizasyon gerektiren veya endojen glukokortikoid üretimini etkileyen bileşikler tarafından glukokortikoid sinyalizasyonu üzerindeki etkileri hassas ve spesifik olarak tespit eder.

Bir Zebra balığı Larva Lusıferaz Muhabir Sistemi ile glukokortikoid Signaling&#39;den için bir Kimyasal Tarama Prosedürü

Laboratuvarımız 7 günlük eski Zebra balığı larvaları birkaç farklı davranışların tespiti için yararlı bir yeni yüksek verimli otomatik görüntüleme sistemi geliştirdi. Sistem, larva çevresel toksik ya da eczacılık maruz kalmış sonra davranış ince değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir.

Zebra balığı Larva otomatik Yüksek verim Davranış Analizleri

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Burada, tasarım ve yüksek işlem hacmi zebra balığı embriyo bir 96-şey plaka diziliyor için böyle şablon kullanımı ayrıntılı yordam tarafından ardından arraying bir zebra balığı embriyo imal için bir protokol mevcut.

3 boyutlu (3D)-yüksek işlem hacmi zebra balığı diziliyor embriyo için şablon basılı

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Zebra balığı embriyo titreşimi ürkütücü tepkisine dayalı olarak kimyasal bileşik toksisitesini değerlendirmek için bir tarama sisteminin iş akışını ve veri analizini açıklıyoruz. Sistem, zebra balığı embriyolarının bir titreşim uyaranına maruz kaldıklarında hareketlerini kaydeder ve genel toksisite/ölümcüllük ve nöromüsküler toksisitenin entegre bir değerlendirmesine izin verir.

Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Keşfedin otomatik görüntüleme ve analiz yöntemini kullanarak zebrafish transgenik embriyolarında yüksek verimli kimyasal tarama. BCI molekülünün FGF sinyal yolağı üzerindeki doza bağımlı etkilerini ölçün ve geliştirme biyolojisi araştırmalarını hızlandırın.

Zebrafish kimyasal ekranlar için otomatik görüntüleme ve analiz geliştirilmesi.

Daha fazla video keşfet