Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

Bu prosedürün genel amacı, gen ekspresyonunu incelemek için siRNA'ları transfekte edilmesi zor hücrelere sokmak için elektroporasyon kullanmaktır. Bu, önce TC 10 kullanılarak ihtiyaç duyulan awa hücre süspansiyonu miktarının belirlenmesiyle gerçekleştirilir. Otomatik hücre sayacı irna daha sonra hücre süspansiyonuna eklenir ve hücreler elektro oluşturulur.

MXL elektroporasyon sistemi kullanılarak, hücreler elektroporasyondan sonra 24 saat boyunca inkübe edilir. Daha sonra, deney hücrelerinde gen transkripsiyonunu indüklemek için IL dört eklenir. Son olarak, RNA ekstrakte edilir ve gen ekspresyon seviyelerini ölçmek için gerçek zamanlı PCR kullanılır.

Sonuç olarak, spesifik siRNA'ların gen ekspresyon yolları üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Adam McCoy, Bio Rad Laboratories'in gen ekspresyonu bölümünde kıdemli bilim adamıyım. Bugün size RNA'ları elektroporasyon yoluyla transfekte edilmesi zor bir hücre hattına sokma prosedürünü göstereceğiz ve ardından gen ekspresyonu üzerindeki etkilerine bakacağız.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, tek genlerin gen ekspresyonunu analiz etmek veya bir geni devre dışı bırakarak ve aşağı akış etkilerini arayarak gen yollarını incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Bir hücre kültürü başlığı altında çalışarak, hücreleri bir kültür şişesinden çıkarın.

Bu protokolde kullanılan hücreler askı hücreleridir. Yapışık bir hücre kullanıyorsanız, onları çıkarmadan önce tripsin gözleri almanız gerekecektir. Hücreleri pelet yapmak için santrifüjleyin.

Hücreler döndürüldükten sonra, süpernatanı çıkarın ve hücreleri PBS'de yeniden askıya alın. Canlı hücrelerin sayısını belirlemek için, hücre süspansiyonunun bir alikotunu alın ve ölü hücreleri lekelemek için bire bir oranında trian mavisi boyası ekleyin. Trian mavisi, canlı ölü hücre değerlendirmesi için gereklidir, ancak toplam hücre sayısı için gerekli değildir.

Karışımı sadece tek kullanımlık bir sayma sürgüsünün ağzına sıkın ve TC 10 otomatik hücre sayacına yerleştirin. TC 10, en doğru sayımı sağlamak için önce otomatik odaklama yapacak ve ardından hücreleri saymaya başlayacağız. Örnekteki mililitre başına canlı ve toplam hücre sayısı görüntülenir.

Hücreleri görünüm ekranında görüntülemek için görüntüyü görüntüle'yi seçin. Ardından yukarı veya aşağı okları kullanarak. Deneyler için gereken hücre süspansiyonu miktarını hesaplamak için gerektiği kadar yakınlaştırın veya uzaklaştırın, seyreltme hesaplayıcısını seçin.

Bu deney için istenen konsantrasyon ve nihai hacim değerlerini girin. Her tedavi için kopyalar dahil olmak üzere toplam 16 numune hazırlanacaktır. Bu nedenle, mililitre süspansiyonu başına altı hücrenin toplam 3.6 mililitresine beş kez 10 mililitreye ihtiyaç duyulacaktır.

Hücre sayacı daha sonra canlı hücre sayısına ve girilen hedef değerlere dayalı olarak gereken hücre süspansiyon hacmini bildirecektir. TRIAM blue kullanılmışsa, sayaç kullanılan bire bir seyreltme için otomatik olarak ayarlanacaktır. Şimdi bir kaputun altında, hesaplanan hücre süspansiyon hacmini yeni bir tüpe aktarın.

Daha sonra, hücreler dönerken hücreleri peletlemek için hücre karışımlarını döndürün. Her tüpe SIR A ekleyerek elektroporasyon için mikro fuge tüpleri hazırlayın. Bu deney için, bir kontrol irna iki stat altı spesifik siRNA ve rezeke edilmemiş kontroller hazırlanacaktır Santrifüjlemeyi takiben, PBS'yi çıkarın ve hücreleri 3.6 mililitre gen Pulser elektroporasyon tamponu içinde yeniden süspanse edin, 800 mikrolitre alikotları uygun IRNA'yı içeren tüplere aktarın ve hafifçe karıştırın.

Hücreler artık tüm örnekleri aynı anda yemek için elektroporasyona hazırdır. MXL elektroporasyon sistemini kullanarak, her hücre süspansiyonunun 150 mikrolitresini 96 kuyulu bir elektroporasyon plakasının uygun kuyularına aktarın. Ardından, plakayı MXL elektroporasyon sisteminin plaka haznesine yerleştirin ve kapağı kapatın.

İstenen elektroporasyon protokolünü seçin ve elektroporasyon tamamlandıktan sonra hücreleri yemek için nabza basın, plakayı cihazdan çıkarın ve hücreleri orta ila ön ısıtma içeren yeni bir doku kültürü plakasına aktarın. Daha sonra, her numune için 150 mikrolitre derecelendirilmemiş kontrol hücresini yeni tabağa aktarın. Ardından hücreleri gece boyunca 37 santigrat dereceye, %5 karbondioksite yerleştirin.

24 saat sonra, bir hücre setinde gen transkripsiyonunu indüklemek için IL four'u kullanın ve sadece ikinci sete ortam ekleyin. Hücrelere bir IL dört eklenir. Toplam 24 saatlik büyümeden sonra 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 48 saat daha inkübe edin.

Deneysel tedavi hücre bölünmesini etkiliyorsa hücre yoğunluğunda büyük farklılıklar olabilir. Bu nedenle, hücre sayımlarına göre hücreleri tekrar hızlı bir şekilde saymak için TC 10 otomatik hücre sayacını kullanmak iyi bir fikirdir. RNA ekstraksiyonu ve dondurma için her oyuktan bir alikotu bir mikro füj tüpüne aktarın.

Batı lekeleme veya diğer protein analizleri için ikinci bir alikot. Bugün sadece RNA iş akışı gösterilecektir. Hücreleri peletlemek için numuneleri santrifüjleyin.

Ardından SUP natin'i her tüpten çıkarın ve atın. Orum toplam RNA kitini kullanarak RNA ekstraksiyonuna devam edin. RNA ekstrakte edildikten sonra, numuneleri buz üzerinde tutarak hemen analize devam edin.

RNA kalitesini ve miktarını tek adımda doğrulamak için Experian otomatik elektroforez istasyonunu kullanın, numuneleri ısıdan arındırın ve Experian RNA merdivenini kullanın ve buzun üzerine yerleştirin. Hazırlanmış bir jel karışımı ekleyin ve astara sürün. Bir RNA çipi üzerinde, hazırlama istasyonundaki hazırlama kodunu ayarlayın.

Çipi otomatik hazırlama istasyonuna yerleştirin ve başlat düğmesine basın. Talaşı hazırlama istasyonundan çıkarın ve talaşı yükleyin. Numuneleri yükleme tamponu ile karıştırmak için çipi girdaplayın.

Çipi elektroforez istasyonuna yerleştirin ve çalıştırmaya başlayın. Experian yazılımı, sonuçları otomatik olarak bir elektroferogram, RNA konsantrasyonu ribozomal oranını gösteren bir sonuç tablosu ve RNA kalite gösterge numarası ve geleneksel bir RNA jeline benzeyen sanal bir jel şeklinde görüntüler. Yüksek kaliteli toplam RNA örnekleri tipik olarak sekiz ila 10 arasında bir RQI'ye sahip olacaktır.

RNA kalitesini doğruladıktan sonra, CD NA reaksiyonlarını burada hazırlayın. IS komut dosyası ONEstep R-T-P-C-R karışımı, CD, NA sentezi ve gerçek zamanlı PCR'yi birleştirmek için kullanılır. Bir reaksiyonda, her bir primer seti için RNA şablonları dışındaki tüm reaksiyon bileşenlerini içeren bir ana karışım yapın.

Ardından karışımı bir PCR plakasının kuyucuklarına dağıtın. RNA'yı homojen bir konsantrasyona seyrelttikten sonra, numuneleri uygun kuyucuklara ekleyin ve üçe katlayın. Plakayı kapatın, gerçek zamanlı PCR makinesine yerleştirin, ardından uygun protokolü seçin ve çalıştırma tamamlandıktan sonra çalıştırmaya başlayın, ifade seviyelerini belirlemek için gerçek zamanlı izleri kullanın.

Yazılım, tedavi edilen ve kontrol edilen hücrelerdeki deneysel ve referans genlerin göreceli ifadesine dayalı olarak verilerden normalleştirilmiş gen ekspresyonunu hesaplar. Bu şekil, IL dördünün reseptörüne bağlanan IL dört sinyal yoluna genel bir bakışı göstermektedir. STAT altı'nın diarizasyonuna ve aktivasyonuna yol açar, aktive edilmiş STAT altı çekirdeğe yer değiştirir ve hedefinin transkripsiyonunu aktive eder.

CCL 17'nin IL dört indüksiyon transkripsiyonu olmayan CCL 17 gibi genler, STAT altı geninin irna aracılı susturulmasından sonra düşük yapısal seviyelerde kalacaktır. IL dört ile tedavi, CCL 17 ekspresyonunda çok az artışa veya hiç artışa yol açmamalıdır. CCL 17'nin IL four ile indüksiyonu, farklı koşullarda kantitatif gerçek zamanlı olarak ölçüldü.

IL dört olmadan yetiştirilen PCR örnekleri, düşük bir kurucu ekspresyon seviyesine sahipti. Efendimden bağımsız olarak, yeşil ve mavi kontrol örneklerinde gösterildiği gibi verilen A, CCL 17'nin sekiz ila on kat indüksiyonu ile IL dört ile tedaviye normal olarak yanıt verdi. Bununla birlikte, kırmızı ve pembe renkte gösterilen STAT altıyı hedefleyen siRNA'larla transfekte edilen hücreler, IL dördüne yanıt olarak CCL L 17 ekspresyonunu azaltmıştır ve STAT altının, CCL 17'nin IL dört ile indüklenen ekspresyonunda bir rol oynadığı fikrini desteklemektedir.

Size siRNA'ları transfekte edilmesi zor bir süspansiyon hücre hattına nasıl yerleştireceğinizi ve bu hücrelerde bir gen ekspresyonunu nasıl takip edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, tüm örneklerde her şeyi mümkün olduğunca tutarlı tutmayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.