Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

Bu prosedürün genel amacı, gen ekspresyonunu incelemek için transfeksiyonu zor hücrelere elektroporasyon yöntemiyle siRNA'lar aktarmaktır. Bu işlem, öncelikle TC 10 Otomatik hücre sayıcı kullanılarak gereken hücre süspansiyonu miktarının belirlenmesiyle gerçekleştirilir; ardından siRNA hücre süspansiyonuna eklenir ve hücreler elektropore edilir.

MXL elektroporasyon sistemi kullanılarak, hücreler elektroporasyon sonrası 24 saat boyunca inkübe edilir. Ardından, deneysel hücrelerde gen transkripsiyonunu indüklemek için IL-4 eklenir. Son olarak, RNA ekstre edilir ve gen ekspresyon seviyelerini ölçmek için gerçek zamanlı PCR kullanılır.

Nihayetinde, spesifik siRNA'ların gen ekspresyon yolakları üzerindeki etkisini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, ben Adam McCoy, Bio Rad Laboratories gen ekspresyon bölümü kıdemli bilim insanıyım. Bugün size, transfekte edilmesi zor olan hücre hatlarına elektroporasyon yoluyla RNA aktarma prosedürünü göstereceğiz ve ardından gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini inceleyeceğiz.

Laboratuvarımızda bu prosedürü, tekil genlerin ekspresyonunu analiz etmek veya bir geni nakavt ederek alt akış etkilerini incelemek suretiyle gen yolaklarını çalışmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Hücre kültürü kabininde çalışarak, hücreleri kültür flaskından çıkarın.

Bu protokolde kullanılan hücreler süspansiyon hücreleridir. Eğer adherent hücreler kullanıyorsanız, hücreleri uzaklaştırmadan önce tripsinizasyon yapmanız gerekecektir. Hücreleri peletlemek için santrifüjleyin.

Hücreler santrifüj edildikten sonra, süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri PBS içerisinde yeniden süspande edin. Canlı hücre sayısını belirlemek için, hücre süspansiyonundan bir alikot alın ve ölü hücreleri boyamak amacıyla bir bire bir oranında tripan mavisi boyası ekleyin. Tripan mavisi, canlı-ölü hücre değerlendirmesi için gereklidir ancak toplam hücre sayımı için gerekli değildir.

Karışımı sadece tek kullanımlık bir sayım lamının açıklığına pipetleyin ve bunu TC 10 otomatik hücre sayıcısına yerleştirin. TC 10, en doğru sayımı sağlamak için önce otomatik odaklama yapacak ve ardından hücrelerin sayımına başlayacaktır. Örnekteki mililitre başına canlı ve toplam hücre sayısı ekranda görüntülenir.

Hücreleri görüntüleme ekranında göstermek için görüntüleme resmini seçin. Ardından, yukarı veya aşağı oklarını kullanarak, deneyler için gereken hücre süspansiyonu miktarını hesaplamak amacıyla gerektiği kadar yakınlaştırın veya uzaklaştırın ve seyreltme hesaplayıcısını seçin.

Bu deney için istenen konsantrasyon ve final hacim değerlerini girin. Her işlem için tekrarlar dahil olmak üzere toplam 16 örnek hazırlanacaktır. Bu nedenle, mililitre başına 5 × 10⁶ hücre içeren süspansiyondan toplam 3,6 mililitre gerekecektir.

Hücre sayıcı, canlı hücre sayısına ve girilen hedef değerlere dayanarak gereken hücre süspansiyonu hacmini raporlayacaktır. Eğer TRIAM blue kullanıldıysa, sayıcı kullanılan bire bir seyreltme için otomatik olarak ayarlama yapacaktır. Şimdi bir steril kabin altında, hesaplanan hücre süspansiyonu hacmini yeni bir tüpe aktarın.

Ardından, hücreleri çöktürmek için hücre karışımlarını santrifüjleyin. Her tüpe SIR A ekleyerek elektroporasyon için mikro santrifüj tüplerini hazırlayın. Bu deney için, bir kontrol irna, iki stat altı spesifik siRNA ve rezeke edilmemiş kontroller hazırlanacaktır. Santrifüj işleminin ardından PBS'yi uzaklaştırın ve hücreleri 3,6 mililitre gene Pulser elektroporasyon tamponunda yeniden süspande edin; uygun IRNA içeren tüplere 800 mikrolitre'lik alikotlar aktarın ve nazikçe karıştırın.

Hücreler, tüm örneklerin eş zamanlı olarak elektroporasyonuna hazır hale getirilmiştir. MXL elektroporasyon sistemini kullanarak, her bir hücre süspansiyonundan 150 microliters miktarını 96 kuyucuklu bir elektroporasyon plakasının uygun kuyucuklarına aktarın. Ardından, plakayı MXL elektroporasyon sisteminin plaka haznesine yerleştirin ve kapağı kapatın.

İstenen elektroporasyon protokolünü seçin ve hücreleri elektropore etmek için pulse düğmesine basın; elektroporasyon tamamlandıktan sonra plakayı cihazdan çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış besiyeri içeren yeni bir doku kültürü plağına aktarın. Ardından, her örnek için 150 µL derecelendirilmemiş kontrol hücresini yeni kaba aktarın. Son olarak hücreleri 37 °C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.

24 saat sonra, bir grup hücrede gen transkripsiyonunu indüklemek için IL four kullanın ve ikinci gruba sadece besiyeri ekleyin. Hücrelere bir adet IL four eklenir. Toplam 48 saatlik büyüme süresinin ardından, 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında 24 saat daha inkübe edin.

Deneysel işlem hücre bölünmesini etkiliyorsa, hücre yoğunluğunda büyük farklılıklar oluşabilir. Bu nedenle, hücre sayılarına dayanarak hücreleri hızlıca yeniden saymak için TC 10 otomatik hücre sayıcısını kullanmak iyi bir fikirdir. RNA ekstraksiyonu için her kuyucuktan bir alikotu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve dondurun.

Western blotting veya diğer protein analizleri için ikinci bir alikot. Bugün yalnızca RNA iş akışı gösterilecektir. Hücreleri çöktürmek için örnekleri santrifüjleyin.

Ardından, her tüpteki SUP natin'i uzaklaştırıp atın. orum total RNA kiti kullanarak RNA ekstraksiyonuna devam edin. RNA ekstrakte edildikten sonra, örnekleri buz üzerinde tutarak analiz aşamasına hemen geçin.

RNA kalitesini ve miktarını tek adımda doğrulamak için, Experian otomatik elektroforez istasyonunu kullanarak örnekleri ve Experian RNA merdivenini ısı ile denatüre edin ve buzdolabında bekletin. Hazırlanan jel ve boya karışımını primerlemeye ekleyin. Bir RNA çipi üzerindeki kuyuya, primerleme istasyonundaki primerleme kodunu ayarlayın.

Çipi otomatik hazırlama istasyonuna yerleştirin ve başlat düğmesine basın. Çipi hazırlama istasyonundan çıkarın ve çipi yükleyin. Numuneleri yükleme tamponu ile karıştırmak için çipi vorteksleyin.

Çipi elektroforez istasyonuna yerleştirin ve çalışmayı başlatın. Experian yazılımı; sonuçları otomatik olarak bir elektroferogram, RNA konsantrasyonu ve ribozomal oranı gösteren bir sonuç tablosu, RNA kalite gösterge (RQI) numarası ve geleneksel bir RNA jeline benzer görünen sanal bir jel şeklinde görüntüleyecektir. Yüksek kaliteli total RNA örnekleri genellikle 8 ila 10 arasında bir RQI değerine sahip olacaktır.

RNA kalitesi doğrulandıktan sonra, cDNA sentez reaksiyonlarını hazırlayın. cDNA sentezi ve gerçek zamanlı PCR'ı birleştirmek için IS script ONEstep RT-PCR karışımı kullanılır. Her primer seti için, RNA şablonları hariç tüm reaksiyon bileşenlerini içeren bir ana karışım (master mix) hazırlayın.

Ardından karışımı bir PCR plakası kuyucuklarına dağıtın. RNA'yı homojen bir konsantrasyona seyrelttikten sonra, örnekleri uygun kuyucuklara üç tekrarlı olarak ekleyin. Plakayı kapatın, gerçek zamanlı PCR cihazına yerleştirin, ardından uygun protokolü seçin ve çalışmayı başlatın; çalışma tamamlandığında, ekspresyon seviyelerini belirlemek için gerçek zamanlı izleri kullanın.

Yazılım, işlem görmüş ve kontrol hücrelerindeki deneysel ve referans genlerin bağıl ifadesine dayanarak verilerden normalize edilmiş gen ifadesini hesaplar. Bu şekil, IL four sinyal yolunun genel görünümünü, IL four'un reseptörüne bağlanmasını göstermektedir. Bu durum, STAT six'nın dimerizasyonuna ve aktivasyonuna yol açar; aktive olan STAT six çekirdeğe transloke olur ve hedefinin transkripsiyonunu aktive eder.

IL four indüksiyonu olmayan CCL 17 gibi genlerin transkripsiyonu, STAT six geninin irna aracılı susturulmasından sonra düşük konstitütif seviyelerde kalacaktır. IL four ile tedavi, CCL 17 ekspresyonunda çok az artışa yol açmalı veya hiç artışa yol açmamalıdır. IL four tarafından CCL 17 indüksiyonu, farklı koşullar altında kantitatif gerçek zamanlı yöntemle ölçülmüştür.

IL 4 olmadan büyütülen PCR örneklerinde düşük düzeyde konstitütif ekspresyon gözlendi. siRNA'dan bağımsız olarak, yeşil ve mavi ile gösterilen kontrol örnekleri, CCL 17'de sekiz ila on katlık bir indüksiyon ile IL 4 tedavisine normal yanıt verdi. Ancak, kırmızı ve pembe ile gösterilen STAT 6'yı hedefleyen siRNA'lar ile transfekte edilen hücrelerin IL 4'e yanıt olarak CCL 17 ekspresyonu azalmıştı; bu durum, STAT 6'nın IL 4 tarafından indüklenen CCL 17 ekspresyonunda rol oynadığı fikrini desteklemektedir.

Transfekte edilmesi zor bir süspansiyon hücre hattına siRNA'ların nasıl aktarılacağını ve bu hücrelerde gen ekspresyonunun nasıl takip edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, tüm örnekler arasında tutarlılığı mümkün olduğunca korumanın önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.