Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yapısal kütle spektrometresi kullanarak büyük protein düzeneklerini karakterize etmektir. Bu, nano akışlı elektro sprey iyonizasyonu için altın kaplama kılcal damarlar hazırlanarak elde edilir. İkinci adım olarak numune hazırlanır ve kütle spektrometresi yüksek kütle ölçümleri için kalibre edilir.

Daha sonra, protein komplekslerini gaz fazında sağlam tutmak için deneysel koşullar optimize edilir. MS ve tandem Ms.Spectra daha sonra satın alınır. MS Spektrumları, sağlam komplekse kütle olarak karşılık gelen yük durumlarını gösterirken, tandem MS deneyleri, monomerlerin ve soyulmuş komplekslerin birleşme modelini verdi.

Merhaba, ben Whiteman Bilim Enstitüsü'ndeki Miron Laboratuvarı'ndan Naam Kiba ve ben Isaac Ky.Ben de michelon laboratuvarındanım. Bugün size yapısal spektrometri uygulayarak büyük protein komplekslerini analiz etmek için temel prosedürü göstermek istiyoruz, Ve bu prosedürü laboratuvarımızda, stok geometrinizi, bileşiminizi ve etkileşim ağlarınızı tanımlamak için protein komplekslerini karakterize etmek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Akıma bağlı olmayan protein komplekslerinin analizi, emme plus veya qua capiller kullanılarak hava spreyi bağışıklama tekniği ile gerçekleştirilir. Bu kılcal C, yaklaşık bir mikron çapındaki ince uca çekilebilir ve daha sonra altın gibi iletken bir malzeme ile kaplanabilir. Bu kılcal damarlar, burada görebileceğiniz gibi ticari olarak temin edilebilir.

Ancak, kullanımı çok daha uygun maliyetlidir. Daha sonra soğutulabilen ve kullanıma hazır duruma kadar kaplanabilen cam kılcal damarlar, bu iğne havuzlama cihazı üzerinde gerçekleştirilir ve bu eh kaplama cihazı üzerinde kaplama yapılır. Bu prosedüre başlamak için, şeritleri iki santimetre aralıklı tutarak bir Petri kabının dibine çift taraflı bir yapışkan pedin iki şeridini takın.

Pedlerden birinin ortasına bir cam çubuk yerleştirin. Yapışkan ped kılcal damarları yerinde tutar ve cam çubuk hazırlanan kılcal damarları destekler ve kılcal damarlar için uçların kırılmasını engeller. Bir milimetre dış çapa ve 0.78 milimetre çapa sahip Boris silikat cam kılcal damarlar kullanılır.

İğneye bir kılcal damar yerleştirin, kılcal damarı nazikçe yerine toplayın ve konumunu, ısıtma Filamentinin merkezinde olacak şekilde ayarlayın. Kılcal damarlar her iki uçta da sağlam kalana kadar kelepçeleri nazikçe sıkın. Burada gösterilen önceden tanımlanmış programı kullanarak kılcal damarı çekin.

Ancak, çektirmeyi programlama işleminin deneme yanılma sürecinden biri olduğunu unutmayın. Kabul edilebilir bir uç şekli elde edilene kadar, çekilen her kılcal damar iki nihai şekilli kılcal damara yol açar. Çekilen kılcal damarları aletten çıkarın ve deforme olmuş veya kırılmış olanları atarak uçları inceleyin.

Kılcal damarları Petri kabına yerleştirmek için künt konumlandırma cımbızı kullanın. Yapışkan pede tutturulmuş kılcal damarların tabanı ve üst kısım, bir ucu yukarı bakacak şekilde cam çubuğa yaslanır. Petri kabı dolana kadar kılcal damarları çekmeye devam edin.

10 santimetre çapındaki bir tabağa yaklaşık 80 kılcal damar sığar. Sonra, kılcal damarları altınla kaplayın. Plakayı altın püskürtme kabına yerleştirin.

Gaz kaynağının üreticinin talimatlarına göre seçildiğinden emin olun ve önceden tanımlanmış bir kaplama döngüsünü etkinleştirin. Kaplama, kılcal damarlar eşit şekilde altın olana kadar üç ila altı kez tekrarlanır. Kılcal damarlar hazır olduğunda, kütle spektrometresini kalibre etmeye devam edin.

MultiPro kompleksleri üzerinde yapılan deneylerin çoğu, bunun gibi bir Electrospray dörtlü uçuş süresi kütle spektrometresi ile gerçekleştirilir. Yüksek kütleler için modifiye edilmiş sulardan inupt. Protein örneğini yüklemeden önce, kütle spektrometresini sezyum iyodür kullanarak kalibre edin.

İlk olarak, arıtılmış suda mililitre başına 100 miligramlık bir sezyum çözeltisi hazırlayın, Sezyum yüksek kütle kalibrasyonu için kullanılır. Tek başına yüklü tuz kümeleri, 393 direkten 10.000'in üzerine kadar geniş bir kütle aralığına yayılır. Künt cımbız kullanarak, Petri kabından kaplanmış bir kılcal damar alın ve iki mikrolitre sezyum çözeltisi kılcal damara yükleyin.

Einor jel yüklü bir uç kullanarak. Solüsyonu kılcal damarın ucuna doğru manuel olarak veya bir döndürme adaptörü kullanarak kaydırın. Kılcallığı kılcal tutucuya yerleştirin ve kılcalayı, ucu tutucunun kenarından yaklaşık 10 milimetre uzakta olacak şekilde ayarlayın.

Kılcal damarı optik mikroskop altına yerleştirin ve ucu kesmek için keskin AA tipi cımbız kullanın. Kılcal damar içinde akışı engelleyebilecek hava kabarcıkları olmadığını ve kılcal damarın tıkalı olmadığını doğrulamak önemlidir. Ek olarak, altın kaplamanın kılcal damardan sıyrılmadığından emin olun.

Eğer öyleyse, kılcal damarı değiştirin veya ucu kesin ve kaplanmamış kısmı çıkarın. Ardından, kılcal tutucuyu nano akış ESI arayüzüne bağlayın. Kılcal damara zarar vermemek için XY, Z aşamasını geriye doğru döndürün ve aşamayı etkin konumuna itin.

Kılcal damar, koni deliğinden bir ila 10 milimetre mesafeye yerleştirilmelidir. Püskürtme başlatılana kadar kılcal voltaj ve düşük nano akış basıncı uygulayın. Ardından nano akış basıncını minimum bir değere düşürmeye çalışın.

XYZ aşamasının konumunu, kılcal voltajı, nano akış basıncını ve diss çözme gazı akışını ayarlayarak sinyal yoğunluğunu optimize edin. Sezonluk tepe serilerinin geniş bir kütle aralığını tespit etmek için, hızlanma voltajları optimize edilmelidir. Burada kullanılan parametreler, 1.3 ila 1.7 kilovolt kılcal numune konisi 80 ila 150 volt, bir ekstraksiyon konisi, yumuşak desal koşullar gerektiren yüksek kütleli iyonların iletimini optimize etmek için bir ila üç volttur.

Destek basıncı, kaynak ile analizör arasındaki ilk vakum aşamasında beş ila altı milibar'a yükseltilir. Destek basıncını yükseltmek için, sinyal yoğunluğu üzerindeki etkiyi izlerken izolasyon vanasını kısmen kapatarak kaynak vakum hattının scroll pompaya olan iletkenliğini dikkatlice azaltın. Kütle spektrometrelerini kurarken, edinimden sonra 1000 ila 15.000 arasında bir ana şarj oranı aralığında saniyede bir taramada yaklaşık 30 tarama toplayın, uygun kalibrasyon tablosunu kullanarak uçuş süresini kalibre edin.

Artık kalibrasyon tamamlandığına göre, protein numunesi yüklenebilir. Kütle spektrometresi kalibre edilmeden önce numune hazırlanır, düşük mikromolar konsantrasyonlar gereklidir. Gerekirse, santrifüjlü ultra filtrasyon cihazları kullanarak numuneyi konsantre edin.

Kullanmadan önce protein kompleksinin cihaz zarı tarafından emilmediğini doğrulayın. Hacmi ve UV absorbansını kontrol ederek, NESI için yalnızca uçucu çözeltiler kullanılabilir, bu da genellikle tampon değişimini gerekli kılar. Bir mikro santrifüj jel filtrasyon kolonu, tüm tuz izlerini, tampon moleküllerini veya diğer uçucu olmayan eklentileri gidermek için kullanılabilir.

Bunun yerine, örneği askıya alın. Sulu bir amonyum asetat çözeltisi. Bu kritik adım, spektrumların kalitesini belirler.

Maksimum değişim sağlanana kadar cihaz başına 1,3 faktörden daha az, minimum seyreltme ile tampon değişimini üç defaya kadar tekrarlayın. Hem konsantrasyon hem de tampon değişimi gerekliyse, bunlar bu bölümün başında gösterildiği gibi santrifüjlü ultra filtrasyon kullanılarak birlikte yapılabilir. Ardından, numuneyi sezyum iyodür kalibrasyonu için gösterildiği gibi yükleyin ve püskürtmeyi başlatın.

Sinyal algılanana kadar spreyin ilk optimizasyonu ile başlayın. M'nin kompleksin kütlesi olduğu gösterilen ortalama yük durumu için denklemi kullanın. Bununla birlikte, Daltonlarda, yük durumlarının tam konumu proteine bağlıdır.

Karmaşık ayrışmayı önlemek için demir kaynağını ısıtmayın. Isıtıcıyı kapatın veya sıcaklığı 40 santigrat derecenin altında tutun. Kılcal pozisyonu, numune konisini ve çıkarıcı voltajlarını değiştirin.

Demir iletimini en üst düzeye çıkarmak için olası bir başlangıç noktası koni voltajı, 100 volt aspiratör konisi, bir volt ve kılcal voltaj 1,5 kilovolttur. Spektrumda ortaya çıkan değişikliği kontrol edin. Bozulmayı iyileştirmek ve artık su ve tampon bileşenlerini çıkarmak için bu parametreleri bir nano akış basıncıyla birlikte optimize edin.

Çarpışma hücresindeki gaz basıncındaki öngerilim voltajını artırın. Tipik öngerilim gerilimleri, dakikada bir ila 10 mililitre tuzak gaz akışı ile 10 ila 100 volt aralığındadır. Kompleksin birleşmesini önlemek, tuzağı ayarlamak ve çarpışma enerjilerini aktarmak için bunu dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.

Genellikle, yüksek kütleli iyonların iletimi için genellikle 10 ila 30 volt aralığında daha yüksek voltajlar gereklidir. Bu noktada, burada gösterildiği gibi kompleksin çarpışma kaynaklı ayrışmasını önlemek önemlidir. Kararlı bir sinyale ulaşıldıktan sonra, kararlı spreyi korurken nano akış basıncının ve kılcal voltajın minimum değerlere düşürülmesi önerilmiştir.

Birkaç tarama topladıktan sonra, kompleksin bileşenlerini tandem kütle spektrometresi ile tanımlamaya devam edin. Protein kompleksi için optimum ve kararlı bir sinyal elde edildikten sonra, kütle merkezini izolasyon genişliğinde ayarlayın bir öncü iyon seçin. Genel olarak, 12'lik düşük bir kütle çözünürlüğü ve 13 ile 15 arasında yüksek bir kütle çözünürlüğü, yüksek kütleli düşük yük ayrışma ürünlerini tespit etmek için geniş bir kütle aralığı kullanır ve ardından bunu istenen değerlere düşürür ms gerçekleştirmek için.

MS öncü demiri ayrıştırır: Çarpışma enerjisini, kısaltılmış CE'yi ve çarpışma hücresi üzerindeki basıncı artırarak, tuzağı artırın veya CE'yi transfer edin, 10 ila 20 voltluk adımlarla kademeli olarak artırın ve çarpışma gazı basıncını dakikada sıfır ila beş mililitreye yükseltin. Optimum aktivasyon koşullarına ulaşılana kadar spektrumdaki değişiklikleri izleyin. Yüksek aktivasyon enerjisi, bir veya daha fazla alt birimin bozulmamış kompleksten ayrılmasını indükleyebilir ve farklı alt birimlerin etkileşim afinitelerini netleştirebilir.

MS MS analizi için birden fazla ücret seçin. Örtüşen bileşenler söz konusu olduğunda, bir dizi tandem MS Spectra'nın elde edilmesi, farklı popülasyonların yük serilerinin çözülmesine yardımcı olur. Ayrıca, daha yüksek şarj durumları, MS ve ms'nin üzerine binen daha düşük şarj durumlarına kıyasla daha kolay ayrışır.

Seçilen öncü iyonun izolasyonunu doğrulamak için Ms spektrumları. Sağlam kompleksin MS ve MS tarafından karakterizasyonuna ek olarak, MS hafif denatüre edici koşullar altında daha küçük alt kompleksler ve çözeltiler üretir ve bunları da karakterize eder.

Alt komplekslerin MS ve ms MS analizi, alt birim alt birim etkileşimlerinin kısmi bozulması için kompleksin alt birim mimarisini tanımlamak için temel oluşturur kademeli olarak %50'lik bir konsantrasyona kadar organik çözücüler ekleyin veya %4'lük bir konsantrasyona kadar amonyak veya formik asit ekleyerek çözeltinin pH'ını değiştirin Son olarak, Kompleksi oluşturan bireysel alt birimlerin kütlelerini belirlemek için, denatüre edici koşullar altında spektrum elde etmek önemlidir. Bu, elucian çözücü olarak elucian çözücü olarak %1 ile 25 ila 75 su aseto nitril oranına sahip C dört fermuar ucu kullanılarak gerçekleştirilebilir ve toplanan tüm veriler ile proses ve sonuçları ekteki yazılı protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analiz edilebilir. Protein kompleksi numunesini yüklemeden önce, kütle spektrometreleri sezyum iyodür kullanılarak kalibre edilir.

Kırmızı ile işaretlenmiş eşit aralıklı tepe noktaları serisi, 393'lük bir ana şarj oranından 10.000'in çok üzerine kadar geniş bir aralığa yayılır. Sezyum artı kompleksinin genel bileşiminin tuz kümelerini tek tek şarj etmekle görevlendirilirler. Siyahla işaretlenmiş ana tepeler arasındaki ek sinyaller, serinin çift ve üçlü yük türlerinden kaynaklanır: sezyum iki artı kompleksi ve sezyum üç artı kompleksi.

İlk vakum aşamasında basıncın arttırılması, yüksek kütleli kümelerin tespit edilmesi için çok önemlidir. Basıncın yüksek kütle tepe noktaları üzerindeki etkisi burada 1.2 ve 5.3 milibarlık basınç okuma geri okumaları ile gösterilmiştir. Daha yüksek basınç için kütle spektrumu burada genişletilmiş olarak gösterilmiştir.

Burada, 3000 ile 5.000 ana şarj oranı arasında bir yük durumu dağılımına yol açan bir lektin varyant kompleksinin kütle spektrometrisine bir örnek. Bununla birlikte, iyonların yeterli miktarda boşaltılması nedeniyle, tepe noktaları geniştir. Öngerilim voltajının dört volttan 15 volta yükseltilmesi, hızlanma koşullarında bir artışa neden olur, artık suyun sıyrılmasına ve tampon bileşenlerinin sıyrılmasına neden olur ve yüksek oranda çözülmüş bir spektrum verir, ölçülen kütle pentamerik bir komplekse karşılık gelir.

Artı 15 şarj durumu daha sonra tandem MS analizi için seçildi. Çarpışma enerjisindeki artış, 1.664 ana yük oranında merkezlenmiş yüksek yüklü bir monomerin ve 5.000 ila 8.000 kütle yük oranı aralığında soyulmuş bir tetramerik kompleksin salınmasına neden olur. Lektin varyant kompleksi, karmaşık birleşmeye yol açan denatüre edici koşullar altında da incelendi.

Bu şekilde, kompleksi oluşturan bireysel alt birimlerin doğru kütlesi belirlenebilir. Size az önce MS ve yüksek kütleli iyonların tandem Ms Spektrumlarını nasıl elde edeceğinizi gösterdik. Bu prosedürü yaparken, numunenizi uygun şekilde hazırlamanız ve yalnızca kütle spektrometresi ile uyumlu uçuculuk tamponları kullanmanız önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.