Name: Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 35 s
Description: Öğrenin, yapısal kütle spektrometresi kullanarak büyük protein komplekslerinin yapısını ve bileşimini nasıl karakterize edeceğinizi. Bu yöntem, alt birim etkileşimlerini ve kompleks mimarisini anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Sharon grup üyeleri, eleştiri ve el yazması katkıları için teşekkür ederim. Biz destek için Morasha ve Bikura Programlar, İsrail Bilim Vakfı (Grant No 1823-1807 ve 378/08), Biomembrane Araştırma Josef Cohn Minerva Merkezi, Yeni bilim adamları için Chais Aile Fellows Programı, İbrahim minnettarız Sonia Rochlin Vakfı; Wolfson Aile Charitable Trust, Helen ve Milton A. KimmelKimmelman Merkezi Biyomoleküler Yapı ve Meclis için; Shlomo ve Sabine Beirzwinsky emlak; Meil ​​de Botton Aynsley, ve Karen Siem Reap, İngiltere. Biz, bize lektin varyant örnek vermek için, Dan Tawfik ve Itamar Yadid minnettar.

Bölüm 1: nanoflow elektrosprey iyonizasyon için altın kaplı kılcal damarların hazırlanması Non-kovalent kompleksleri analizi genellikle cam veya kuvars kılcal damarları (genellikle altın) (~ 1 mm iç çapı), ince bir ucu iletken bir malzeme ile kaplı çekti kullanarak, nanoflow elektrosprey iyonizasyon (Nesi) 6 tarafından yapılır . Böyle kılcal damarların ticari kaynaklardan (Yeni Amaç veya Proxeon) kullanıma hazır olmakla birlikte, in-house onları hazırlamak için daha fazla maliyet-etkin olabilir: <ol><li> Iki altına 2 cm arayla bir Petri kabı, çift taraflı yapışkan şeritler sopa. Pedleri birinin merkezinde bir cam çubuk (8 cm x 5 mm) yerleştirin. Yerinde kılcal damarlar yapışkan yapacak ve cam çubuk hazırlanan kılcal damarların destek ve kırılma (Şekil 1) ipuçları devam edecektir. </li><li> (Hayır. G100TF-4 Warner Instruments 500 ince duvar borosilikat paketler, kedi.) Borosilikat cam kapilerleri, 1.0 mm OD x 0.78 mm id kullanın. Bir iğne çektirmenin kapiller (Sutter Instrument Co model P-97) içine yerleştirin. İğne çektirmesi ısıtma filament merkezi yatıyor böylece yerine hafifçe kılcal Kelepçe, ve kendi konumunu ayarlamak. Kılcal her iki uçta da firmanın düzenlenen kadar kelepçeler, yavaşça sıkın. </li><li> Önceden tanımlanmış bir program kullanarak, kılcal çekin. Çekti Her kılcal son iki şeklindeki kılcal damarların yol açacaktır. Kabul edilebilir bir ucu şeklini elde edilinceye kadar çektirmenin programlama süreci, deneme-yanılma biri. Biz şu programı kullanabilirsiniz: <table border="1"><tbody><tr><td> Adım </td><td> Isı </td><td> Çekme </td><td> Vell </td><td> Zaman </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 750 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 700 </td><td> - </td><td> 15 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 750 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 80 </td></tr></tbody></table></li><li> Cihazdan çekti kılcal damarları çıkartın ve ipuçları, iptal etme, deforme olmuş veya kırık olduğunu herhangi bir kontrol edin. Petri kabındaki kılcal damarların yer künt cımbız (CK Hassas konumlandırma cımbız kullanın) kullanın. Kapiller tabanı yapışkan bağlı olmalı ve üst kısmı yukarı bakacak ucu, cam çubuk dayanmak gerekir. </li><li> Petri kabı sonra (80, 10 cm çaplı çanak içine kılcal damarların uyum hakkında) dolu, (biz bir model kullanır. EMS550, EMS) coater sputter altın bir tabak yerleştirin. Gaz kaynağı (5 x 10 -2 mbar, 45mA güncel bir vakum basıncı, 4 psi Argon basınç kullanın ve bir kaplama zaman üreticinin talimatlarına göre seçilmiş ve önceden tanımlanmış bir kaplama döngüsü etkinleştirmek olduğundan emin olun . 1 dakika, 3-6 döngüleri için, kılcal damarlar kadar) eşit altın. </li></ol> Bölüm 2: Örnek hazırlama <ol><li> Düşük örnek mikromolar konsantrasyonları (1 - 20 mcM) ihtiyaç vardır. Gerekirse, santrifüj ultrafiltrasyon cihazlar (örneğin, Sartorius Vivaspin veya NanoSep Pall Corporation) kullanarak örnek konsantre. Kullanmadan önce, cihaz membran protein kompleksi adsorpsiyon doğrulamanız önerilir. </li><li> Genellikle, arıtma tamponlar veya protein kompleksi depolama çözümleri için sadece uçucu çözümler olabilir Nesi ile uyumlu değildir. Bu nedenle, tampon değişimi gereklidir. Bu kritik adım, tuzlar, tampon molekülleri veya gliserol, DTT ya da EDTA gibi diğer uçucu olmayan adducts tüm izlerini defedildiği spektrumlarının kalitesini belirler. Genellikle, sulu amonyum asetat çözeltisi, kullanılan 5 mM ve 1 M arasında bir konsantrasyon ve pH değerlerinde 6-8. Tampon döviz mikrosantrifüj jel filtrasyon sütun (örneğin, Mikro Bio-Bio-Rad Spin 6 kromatografi kolon) kullanılarak yapılabilir. Bu adım, minimum seyreltme (cihaz 5 başına 1.3 kat daha az) ile maksimum döviz elde edilene kadar 1-3 kez tekrar edilebilir. Hem de konsantrasyonu ve tampon değişimi gerekiyorsa, bu santrifüj ultrafiltrasyon (e Pall Corporation, g., Sartorius Vivaspin, ya da NanoSep) ile birlikte yapılabilir olabilir. </li></ol> Bölüm 3: yüksek kitle ölçümleri için kütle spektrometresi Kalibre Çok protein kompleksleri üzerinde yapılan deneylerin çoğu nano elektrosprey kuadropol-time-of-flight (Q-TOF) aracı kullanılarak yapılmaktadır. Iyonlarının yüksek m / z değerleri 7,8 ile iletim ve kitle analizi sağlamak için, düşük frekanslar için ayarlanabilir bir quadrupole kütle filtre kullanmanız tavsiye edilir. .ayrıca gaz girişleri 7,8 veya kollu 9 ilk vakum aşamada basınç kontrolü sağlamak için, ilk iyon kılavuzu enstrüman olması önerilir. Sonuncusu optimizasyonu, iletim ve çok büyük iyonları 7-9 desolvation sağlar. Şu anda, ticari ESI-TOF ve Q-TOF aletleri, yerli MS uygulamaları 7,8, nispeten kolay ve maliyet etkin bir şekilde modifiye edilebilir birkaç üreticileri (örneğin, Waters, SCIEX, Bruker veya Agilent) mevcuttur . Mümkündür, ancak, donanım değişikliği 5 gerek kalmadan 1 MDA kadar kompleksleri için kütle spektrumları elde etmek için, LCT veya QToF1 (Waters) gibi araçlar üzerindeki standart TOF veya QToF yapılandırmaları kullanmak. Synapt aleti (Waters) aşağıda belirtilen protokol yapıldı. <ol><li> Arıtılmış su, CsI 100 mg / ml solüsyon hazırlayın. CsI ​​tek başına ücret tuz kümeleri gibi yüksek kütle kalibrasyon, (CSI) n Cs için kullanılır + 393 m / z 10,000 'in üzerinde (Şekil 2), çok geniş bir kitle yelpazesi uzatmak. </li><li> Künt cımbız kullanarak, bir Eppendorf GeLoader ucunu kullanarak, kılcal Petri kabı ve CsI çözüm yük 2μL kaplı kılcal almak. </li><li> Kılcal kılcal tutucu içine yerleştirin ve kapiler ucu sahibinin kenarından yaklaşık 10 mm uzakta olduğunu bu şekilde ayarlayabilirsiniz. </li><li> Ya da el kılcal ucuna doğru çözüm slayt veya aşağı bir spin adaptörü kullanarak. </li><li> Optik bir mikroskop altında kılcal yerleştirin ve ucu keskin AA-tip cımbız kullanarak düzeltin. </li><li> Kılcal sahibi nanoflow ES arabirimine bağlayın. Kapiller hasar görmesini önlemek için xyz aşamada geriye doğru çevirin ve sahnede aktif konuma itin. Kapiller 1 konulmalıdır - konik delikli 10 mm. </li><li> Sprey başlatılan kadar kılcal gerilimi (1050-1400 V) ve düşük nanoflow basıncı (0,00-,03 bar) uygulayın, daha sonra en az bir değere nanoflow basıncı azaltmak için deneyin. </li><li> Xyz sahne konumu, kılcal gerilim nanoflow basınç ve desolvation gaz akışını ayarlayarak sinyal yoğunluğu optimize edin. </li><li> CsI ​​zirve serisi geniş bir kitle tespit için, hızlanan gerilimler (kılcal 1,3-1,7 kV, örnek koni 80-150V, ekstraksiyon koni 1-3 V, aşağıdaki parametreleri kullanabilirsiniz) optimize edilmelidir. </li><li> Nazik desolvation koşulları, ilk vakum aşamasında desteğini basıncı, kaynak ve analizörü arasındaki gerektiren yüksek kitle iyonlar, iletim optimize etmek için, yükseltilmiş olmalıdır. Bu dikkatle izolasyon vanası (SpeediValve) kısmen kapatarak, kaydırma pompa kaynak vakum hattına iletkenlik azaltarak elde edilebilir. Sinyal yoğunluğu üzerindeki etkisi (genellikle 3,0-6,5 mBar) izlerken optimal noktasını tanımlamak için, ikincisi yapılmalıdır. </li><li> M / z m / z simgesine 15.000 ile 1000 arasında bir mesafeden, 1 tarama / sn 'de yaklaşık 30 taramalar toplayın </li><li> Kazanılmasından sonra, uygun bir kalibrasyon tablosunu kullanarak TOF kalibre edin. </li></ol> Bölüm 4: tam protein kompleksleri MS analizi <ol><li> , Örnek yük olarak tanımlanmıştır (Bölüm 3, Bölüm 2-5) ve sprey başlatabilir. </li><li> Sinyal tespit edilene kadar, sprey ilk optimizasyonu (Bölüm 3, Bölüm 6-9) ile başlayın. Sorumlu devletlerin tam konumunu protein bağımlı; ancak böylece, iyon kütle ve ortalama ücret devlet arasındaki ilişkiyi kullanarak, tahmin edilebilir:, (Z ortalama) 10 Z av = 0,0778 √ (m), hangi m dalton kompleks kitle. Karmaşık disosiasyon önlemek için, iyon kaynağı ısı: ya ısıtıcı kapatın veya sıcaklık 40'ın altında tutmak ° C </li><li> Kılcal konumu, örnek koni ve iyon geçişi en üst düzeye çıkarmak için çıkarıcı gerilimler değişir ve spektrumları meydana gelen değişim kontrol edin. 1 V, kılcal gerilimi 1,5 kV: çıkarıcı koni, olası bir başlangıç ​​noktası koni gerilimi 100 V olabilir. Nanoflow basıncı ile birlikte, bu parametrelerin optimize edin. </li><li> Desolvation geliştirmek ve kalan su ve tampon parçaları şerit, önyargı gerilim ve çarpışma hücre gaz basıncı artar. Bu adım, kompleks disosiasyon önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tipik önyargı gerilimleri bir tuzak gaz akışı ile 1-10 ml / dk (Şekil 3), 10-100 V aralığında. RF ayarı ve kuadropol profili manuel ayar, yüksek kütle iyonları iletimi artırabilir. </li><li> Trap ve Transfer çarpışma enerjileri ayarlayın. Genellikle, yüksek gerilimler, yüksek kütle iyonları (genellikle 10-30 V aralığında) iletimi için gereklidir. Bu noktada, karmaşık çarpışma bağlı disosiasyon önlemek için önemlidir. </li><li> Sonra istikrarlı bir sinyal reached, istikrarlı sprey korurken nanoflow basıncı ve kapiller gerilim, asgari değerler ile azalmış olması tavsiye edilir. </li></ol> Bölüm 5: Tandem kütle spektrometresi: dissociating protein kompleksleri <ol><li> En iyi ve istikrarlı bir sinyal elde edildikten sonra, bir habercisi iyon seçin. Kütle merkezi ve izolasyon genişliği (biz genellikle 12 LM çözünürlük ve 13 ile 15 arasında bir HM çözünürlük) ayarlayın. Yüksek kütle / düşük şarj disosiasyon ürünleri tespit etmek için geniş bir kitle aralığı kullanın. Maksimum seviyeye m / z aralığı ayarlamak önerilir ve sonra istediğiniz değerleri azaltmak. Biz seçilen habercisi iyon izolasyonu daha da doğrulamak için, MS ve MS / MS spektrumları atma öneririz. </li><li> MS / MS gerçekleştirmek için, çarpışma hücre çarpışma enerjisi (CE) ve basıncı artırarak habercisi iyon ayrıştırmaları. Ya tuzak artırın veya 10-20V adımlarla, yavaş yavaş CE aktarın ve 0-5 ml / dk (ortak değerleri) çarpışma gaz basıncını yükseltebilir. Monitör değişiklikleri en iyi aktivasyon koşullarında kadar spektrumları ulaşılır. Yüksek aktivasyon enerjisi, sağlam kompleks bir veya daha fazla alt birimden ayrılma neden ve farklı alt birimden etkileşim yakınlık açıklık olabilir. Biz genellikle daha ağır bir gaz (örneğin, Xe veya SF 6) kullanmanın faydaları bildirilmiş olmasına rağmen, bir çarpışma Tuzak / Transfer hücreleri gaz olarak Argon kullanmak; Ancak, bu gazlar (Şekil 3) 11 önemli ölçüde daha pahalı. </li><li> Bu birden fazla şarj durumu MS / MS analizi için seçilmiş olması tavsiye edilir. Örtüşen bileşenlerin durumda, tandem MS spektrum bir dizi satın farklı popülasyonlar şarj serisi çözümünde yardımcı olacaktır. Ayrıca, yüksek şarj devletlerin daha düşük bir şarj devletler 12 ile karşılaştırıldığında, daha kolay ayrıştırmaları. </li><li> Sağlam kompleks karakterizasyonu yanı sıra, hafif denatüre edici koşullar altında, küçük subcomplexes çözüm olacağını tavsiye edilir. Subcomplexes, MS ve MS / MS analizleri karmaşık 13 altbirim mimarisi tanımlamak için temel oluşturur. Subunit altbirim etkileşimleri kısmi kesinti için, yavaş yavaş% 50 bir konsantrasyon organik çözücüler (örneğin, metanol, izopropanol, ya da asetonitril) eklemek, ya da amonyak veya formik asit (4 bir konsantrasyon ekleyerek çözeltinin pH değişikliği %). </li><li> Kompleksi oluşturan bireysel altbirimden kitleleri belirlemek için, denatüre edici koşullar altında bir spektrum elde etmek için önemlidir. Bu elüsyon çözücü olarak% 1 formik asit, 25:75 su / asetonitril oranı ile ZipTip C 4 (Millipore) kullanılarak yapılabilir. </li></ol> Bölüm 6: Veri işleme ve analiz <ol><li> Veri MS spektrumları, spektral analiz programları kullanarak, çevrimdışı analiz edilir. Biz normalde MassLynx programı (Waters) kullanın. </li><li> Geniş bir m / z aralığı yayılan spektrumları için, bu bölgelerin en yüksek çözünürlük farkı yansıtmak için, yüksek ve düşük m / z bölgeler için yumuşatma ve ağırlık parametreleri farklı planları uygulanabilir öneririz. </li><li> Şarj serisi şarj devletler ve kitleler belirlemek ve hesaplamak için MassLynx fonksiyonu uygulanabilir "manuel". Çakışan bileşenler ile karmaşık bir kütle spektrumlarının durumlarda, elle hesaplama kitlelerin daha kolay olabilir. </li><li> Bu atama işlemleri kolaylaştırmak için, ek bir yazılım olabilir, örneğin: spektrumları deconvolution 14, zirve montaj ve simülasyon 15 için SOMMS, protein subcomplexes kompozisyon ve stokiyometri atama ve protein etkileşim ağları üreten 13,16,17 ZİRVESİ için MaxEnt . </li></ol> Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Altın kaplı nano-elektrosprey kılcal damarların hazırlanması. A. Petri kabı, 2 cm arayla iki adet çift taraflı yapışkan bantlar takın . B. hazırlanan kılcal damarlar destek için, yapışkan hazırlanan kılcal damarların künt sonunda Çubuk pedleri birinin merkezinde bir cam çubuk (8 cm x 5 mm) yerleştirin ve cam çubuk ucu yalın. C. Petri kabı, altın bir ince film eşit kılcal damarların dış yüzey üzerinde biriken kadar altın ile hazırlanan kılcal damarlar, mont ile doludur . <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Sezyum iyodür iyonları kullanarak yüksek kütle kalibrasyonu. CsI ​​büyük ve monisotopic kümeleri yüksek kitle analizi için kütle spektrometre kalibre için tercih edilen bileşik yaptık. Eşit aralıklı zirvelerinden dizi m / z 393 den 10,000 'in üzerinde, geniş bir yelpazede uzatmak. Onlar assigned tek başına genel bileşimi (CSI) n Cs + tuz kümeleri ücret. Önemli zirveleri arasında Ek sinyaller serisi çift ve üçlü ücret türler neden olur; [(CSI) n Cs2] 2 + ve 3 +, sırasıyla [(CSI) n CS3]. Ilk vakum aşamada basıncı artırarak yüksek kitle kümeleri tespit için esastır. Paneller bir yüksek kütle tepeleri üzerinde basınç etkisi olduğunu göstermiştir. B. sırasıyla 1.2 ve 5.3, basınç readbacks ile C. Tayf genişletilmesi B gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1954/1954fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Pentameric lektin Nanoflow elektrosprey kitle spektrumu. A. lektin varyant kompleks Kütle spektrometresi (Lib1-B7 yönlendirilmiş evrim 18 türetilmiş) şarj durumu dağılımları, 3.000 ve 5.000 m / z arasında bir yol verir, ancak iyonları yetersiz desolvation nedeniyle, zirveleri geniş . Karşılaştırma paneli A. ve B. 4V (A) (B) pik genişliği 15V kutuplama gerilimi artan etkisini gösteriyor. Koşullarında hızlanan bu artış, yüksek çözülmesi spektrum verimli, kalan su ve tampon parçaları sıyırma neden olur. Ölçülen kütle (60,240 ± 38 Da) pentameric kompleksine karşılık gelir. C. 15 şarj durumu için tandem MS analizleri (Panel B gri gölgeli.) D seçildi. Çarpışma enerjisi artış 5.000 aralığında, 1664 m / z merkezli bir yüksek tahsil monomer, ve elimden tetramerik kompleksi salınımına neden olur - 8.000 m / z simgesine Tüm spektrumları 0,5 M amonyum asetat 20 mcM çözüm içeren bir örnek elde edildi.

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Benesch, J. L., Ruotolo, B. T., Simmons, D. A., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+complexes+in+the+gas+phase%3A+technology+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein complexes in the gas phase: technology for structural genomics and proteomics.</a> Chem Rev. 107 (8), 3544-3567 (2007).</li>
<li>Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+mass+spectrometry%3A+a+bridge+between+interactomics+and+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology.</a> Nat Methods. 5 (11), 927-933 (2008).</li>
<li>Sharon, M., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+spectrometry+in+structure+elucidation+of+dynamic+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of mass spectrometry in structure elucidation of dynamic protein complexes.</a> Annu Rev Biochem. 76, 167-193 (2007).</li>
<li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 2 (3), 715-726 (2007).</li>
<li>Wilm, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+properties+of+the+nanoelectrospray+ion+source%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analytical properties of the nanoelectrospray ion source.</a> Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).</li>
<li>Sobott, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem+mass+spectrometer+for+improved+transmission+and+analysis+of+large+macromolecular+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A tandem mass spectrometer for improved transmission and analysis of large macromolecular assemblies.</a> Anal Chem. 74 (6), 1402-1407 (2002).</li>
<li>van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+performance+of+a+quadrupole+time-of-flight+instrument+for+macromolecular+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Improving the performance of a quadrupole time-of-flight instrument for macromolecular mass spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (21), 7473-7483 (2006).</li>
<li>Chernushevich, I. V., Thomson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collisional+cooling+of+large+ions+in+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Collisional cooling of large ions in electrospray mass spectrometry.</a> Anal Chem. 76 (6), 1754-1760 (2004).</li>
<li>Mora, dela, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+of+large+multiply+charged+species+proceeds+via+Dole+s+charged+residue+model%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization of large multiply charged species proceeds via Dole s charged residue model.</a> Anal Chim Acta. 406, 93-104 (2000).</li>
<li>Lorenzen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+macromolecular+tandem+mass+spectrometry+of+large+non-covalent+complexes+using+heavy+collision+gases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Optimizing macromolecular tandem mass spectrometry of large non-covalent complexes using heavy collision gases.</a> Int J Mass Spectrom. 268, 198-206 (2007).</li>
<li>Benesch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quadrupole-time-of-flight+mass+spectrometer+modified+for+higher-energy+dissociation+reduces+protein+assemblies+to+peptide+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quadrupole-time-of-flight mass spectrometer modified for higher-energy dissociation reduces protein assemblies to peptide fragments.</a> Anal Chem. 81 (3), 1270-1274 (2009).</li>
<li>Taverner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+intact+protein+complexes+from+mass+spectrometry+and+homology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of intact protein complexes from mass spectrometry and homology modeling.</a> Acc Chem Res. 41 (5), 617-627 (2008).</li>
<li>Ferrige, A. G., Seddon, M. J., Skilling, J., Ordsmith, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+MaxEnt+to+high+resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">The application of MaxEnt to high resolution mass spectrometry.</a> Mass Spectrom. 6, 765-770 (1992).</li>
<li>van Breukelen, B., Barendregt, A., Heck, A. J., van den Heuvel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+stoichiometries+and+oligomeric+states+of+glutamate+synthase+protein+complexes+with+curve+fitting+and+simulation+of+electrospray+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Resolving stoichiometries and oligomeric states of glutamate synthase protein complexes with curve fitting and simulation of electrospray mass spectra.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 20 (16), 2490-2496 (2006).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetrical+modularity+of+the+COP9+signalosome+complex+suggests+its+multifunctionality%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality.</a> Structure. 17 (1), 31-40 (2009).</li>
<li>Hernandez, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+architecture+of+multimeric+complexes+isolated+directly+from+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Subunit architecture of multimeric complexes isolated directly from cells.</a> EMBO Rep. 7 (6), 605-610 (2006).</li>
<li>Yadid, I., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+functional+beta-propeller+lectins+via+homo-oligomeric+assembly+of+shorter+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of functional beta-propeller lectins via homo-oligomeric assembly of shorter fragments.</a> J Mol Biol. 365 (1), 10-17 (2007).</li>
<li>Videler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+intact+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of intact ribosomes.</a> FEBS Lett. 579 (4), 943-947 (2005).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mass+spectrometry+of+viral+assemblies%3A+molecular+composition+and+stability+of+dimorphic+hepatitis+B+virus+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution mass spectrometry of viral assemblies: molecular composition and stability of dimorphic hepatitis B virus capsids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9216-9220 (2008).</li>
<li>Uetrecht, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+and+shape+of+hepatitis+B+virus+capsids+in+vacuo%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Stability and shape of hepatitis B virus capsids in vacuo.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6247-6251 (2008).</li>
<li>Morton, V. L., Stockley, P. G., Stonehouse, N. J., Ashcroft, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+virus+capsid+assembly+from+non-covalent+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Insights into virus capsid assembly from non-covalent mass spectrometry.</a> Mass Spectrom Rev. 27 (6), 575-595 (2008).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((20S+proteasomes+have+the+potential+to+keep+substrates+in+store+for+continual+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">20S proteasomes have the potential to keep substrates in store for continual degradation.</a> J Biol Chem. 281 (14), 9569-9575 (2006).</li>
<li>van Duijn, E., Heck, A. J., Vies, S. M. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inter-ring+communication+allows+the+GroEL+chaperonin+complex+to+distinguish+between+different+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Inter-ring communication allows the GroEL chaperonin complex to distinguish between different substrates.</a> Protein Sci. 16 (5), 956-965 (2007).</li>
<li>van Duijn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+intact+GroEL-substrate+complexes+reveals+substrate-specific+conformational+changes+in+the+trans+ring%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of intact GroEL-substrate complexes reveals substrate-specific conformational changes in the trans ring.</a> J Am Chem Soc. 128 (14), 4694-4702 (2006).</li>
<li>Synowsky, S. A., van Wijk, M., Raijmakers, R., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+multiplexed+mass+spectrometric+analyses+of+endogenously+expressed+yeast+nuclear+and+cytoplasmic+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative multiplexed mass spectrometric analyses of endogenously expressed yeast nuclear and cytoplasmic exosomes.</a> J Mol Biol. 385 (4), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+of+the+19S+proteasome+lid%3A+insights+from+MS+of+intact+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes.</a> PLoS Biol. 4 (8), e267-e267 (2006).</li>
<li>Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+reveals+modularity+and+a+complete+subunit+interaction+map+of+the+eukaryotic+translation+factor+eIF3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry reveals modularity and a complete subunit interaction map of the eukaryotic translation factor eIF3.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18139-18144 (2008).</li>
</ol>

Elde etmek için yüksek kaliteli spektrumları dikkat örnek konsantrasyonu ve tampon değişimi içeren numune hazırlama adımları verilmelidir. Seyreltilmiş örnekleri içinde son derece konsantre örnekler oldukça viskoz ise, düşük sinyal verimi ve elektrosprey iğne bloke olacaktır. Ayrıca, tuzlar, gliserol, deterjan, metal iyonları ve indirgeyici ajanlar (DTT veya β-mercaptoethanol) gibi çözüm katkılar, proteinlerin dış yüzeyi uymak eğilimindedir ve doruklarına genişletilmesi neden. Bu nedenle, iyi bir çözüme doruklarına ulaşmak için, bu bileşenlerin mümkün olan en düşük konsantrasyonlarda ilave edilmelidir. Bir diğer önemli parametre, kılcal nanoflow konumu, kütle spektrometresi orifis göre. &quot;Tatlı nokta&quot; bulma deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir ama yine de spektrumları kalitesini önemli ölçüde etkiler. Nanoflow sprey başlamadan önce kapiller incelemek için de önemlidir. Damlacık boyutu ~ 1 mikrona kadar olmalıdır ucu çapı, bir fonksiyonudur. Küçük damlacıklar daha etkin iyonizasyon kurşun, ve bu nedenle avantajlı olacaktır. Kapiller içinde herhangi bir hava kabarcığı akışını engellemek olduğunu doğrulamak için de önemlidir ve altın kaplama satın alma sırasında kapiller elimden olmadığını, eğer öyleyse, daha fazla ipucu düzeltin. Aşırı miktarda örnek kılcal gerilim, hızlanan gerilimler, basınç, ve çarpışma enerjisi gibi MS koşulları optimize olasılığı artacağı göz önünde bulundurun. Genel olarak, protokol açıklanmıştır usul, sayısız protein kompleksleri bileşimi, stokiyometri ve mimari (bkz. yorumlar 2,3,4) belirlemek için kullanılır olmuştur. Ribozom 19 gibi büyük MDA kompleksleri ve yüksek sipariş virüs capsids 20-22, analizi, moleküler makineler 23-25, veya subunit etkileşim ağları karakterizasyonu için bağlayıcı substratı tanımlayan 26,17,16,17,27,28 olarak hizmet ancak bu yaklaşımın değeri birkaç örnek.

Örnek gereksinimleri: <table border="1"><tr><td> Örnek </td><td> Gereklilik </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Hacim </td><td> 1-2 mcL </td><td> Kapiller Başına </td></tr><tr><td> Konsantrasyon </td><td> 1-20μM </td><td> Karmaşık Başına </td></tr><tr><td> Tampon </td><td> Amonyum asetat gibi Aquanos uçucu tampon pH = 6-8 </td><td> Tipik olarak 5 mM-1M </td></tr><tr><td> Deterjan </td><td> En az </td><td> Deterjan moleküllerinin Kümeleri geniş ve çözülmemiş doruklarına üretir </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Minimal (5%) </td><td> Nonspecifically proteinlere yapışır ve, dolayısıyla, geniş doruklarına gözlenmektedir </td></tr><tr><td> Organik solventler </td><td> % 50&#39;ye varan </td><td> Proteinler kompleksleri denatüre olabilir </td></tr><tr><td> Asitler </td><td> En fazla% 4 </td><td> Denatüre protein kompleksleri </td></tr><tr><td> Tuzlar </td><td> En az </td><td> Tuz adducts geniş ve çözülmemiş zirveleri </td></tr><tr><td> DTT </td><td> En az </td><td> 1-2 mcM mevcut olabilir </td></tr><tr><td> Şelat ajanları </td><td> En az </td><td> 250 mcM şeyden önce kapsamlı adduct oluşumuna yol </td></tr></table>

yapısal kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri analiz

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Yaşayan hücreler kontrol ve dinamik, çok protein kompleksleri 1 bir diziye kendilerini bir araya proteinlerin çok sayıda koordineli eylemler yoluyla kendi biyolojik süreçleri düzenlemektir. Çeşitli hücre süreçlerini mekanistik bir anlayış kazanmak için, bu tür protein komplekslerinin yapısını belirlemek ve yapısal organizasyon işlevi dikte nasıl ortaya çıkarmak için çok önemlidir. Pek çok açıdan çok protein kompleksleri, ancak, heterojen doğası, asimetrik yapısı ve dinamikleri nedeniyle karakterize etmek zor. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar, protein örgütün üçüncül düzeylerinin çalışması için gereklidir. Makromoleküler kompleksleri analiz etmek için ortaya çıkan yapısal biyoloji araçlarını Bir kütle spektrometresi (MS), 2-5 . Bu yöntem karmaşık protein bileşimi, altbirim stokiyometri ve yapısal topolojisi hakkında bilgi verir. MS güç bir sonucu, düşük örnek gereği olarak, endojen düzeyde ifade protein komplekslerinin incelenmesi, yüksek hassasiyet sağlar türemiştir. Diğer bir avantajı, hız, analiz, gerçek zamanlı olarak reaksiyon izlenmesine olanak sağlar. Ayrıca, teknik, aynı zamanda ortak mevcut bir karışımı ayrı popülasyonlarının özelliklerini ölçmek. Burada, biz, büyük protein meclislerinin analizi, yapısal MS uygulama için ayrıntılı bir protokol açıklar. Prosedürü nanoflow elektrosprey iyonizasyon (Nesi) altın kaplı kılcal damarların hazırlanması ile başlar. Daha sonra bir yandan Nesi ile uyumlu olması, ve diğer taraftan sağlam kompleksler korumak için tampon koşulları vurgulanarak, numune hazırlama ile devam ediyor. Daha sonra açıklayacağım, adım adım yüksek kitle ölçümleri için deneysel koşullar optimize etmek ve MS ve tandem MS spektrumları elde etmek için nasıl. Son olarak, veri işleme ve takip analizleri tablosu. Protein meclislerinin her yönüyle karakterize etmek için çalışmadan ziyade, bu protokol, non-kovalent kompleksleri MS ve MS / MS deneyler performans sağlayan, temel MS prosedürleri tanıtır. Genel olarak, hedefimiz, temel deneysel araçları bilgi, yapısal MS alanında tanışmamak araştırmacılar sağlamaktır.

Kütle spektrometresi büyük protein kompleksleri ve analiz etmek için değerli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu yöntem, çok-altbirim meclislerinin bileşimi, stokiyometri ve genel mimari içgörüler sağlar. Burada, tarif, adım-adım yapısal bir kütle spektrometresi analizi gerçekleştirmek ve makromoleküler yapıları karakterize etmek için nasıl.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Canlı hücreler, biyolojik süreçlerini, kendilerini bir ... şeklinde organize eden çok sayıda proteinin koordineli eylemi aracılığıyla kontrol eder ve düzenlerler.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yapısal kütle spektrometrisi kullanarak büyük protein komplekslerini karakterize etmektir. Bu işlem, nano akışlı elektro sprey iyonizasyon için altın kaplama kılcal tüpler hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, numune hazırlanır ve kütle spektrometresi yüksek kütle ölçümleri için kalibre edilir.Ardından, protein komplekslerinin gaz fazında bütünlüğünü korumak amacıyla deneysel koşullar optimize edilir. Daha sonra MS ve tandem MS spektrumları elde edilir. MS spektrumları, kütle bakımından bütün kompleksle eşleşen yük durumlarını gösterirken, tandem MS deneyleri monomerlerin ve soyulmuş komplekslerin birliktelik modellerini ortaya çıkarmıştır.Merhaba, ben Whiteman Bilim Enstitüsü'ndeki Miron Laboratuvarı'ndan Naam Kiba. Ben de Isaac Ky, ben de Michelon laboratuvarındayım. Bugün sizlere yapısal spektrometri uygulayarak büyük protein komplekslerini analiz etmenin temel prosedürünü göstermek istiyoruz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, protein komplekslerinin stok geometrisini, bileşimini ve etkileşim ağlarını tanımlamak ve karakterize etmek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Akım dışı bağlı protein komplekslerinin analizi, as emme plus veya a qua kılcal tüpleri kullanılarak hava spreyi immünizasyon tekniği ile gerçekleştirilir. Bu kılcal tüpler yaklaşık bir mikron çapında ince uçlar haline getirilebilmekte ve ardından altın gibi iletken bir malzeme ile kaplanmaktadır. Bu kılcal tüpler, burada görebileceğiniz üzere ticari olarak temin edilebilir.Bununla birlikte, kullanımı çok daha maliyet etkindir. Hazır kullanıma uygun hale getirilmek üzere soğutulabilen ve kaplanabilen cam kılcallerin soğutma işlemi bu iğne havuzlama cihazında, kaplama işlemi ise bu kaplama cihazında gerçekleştirilir. Bu prosedüre başlamak için, iki şerit çift taraflı yapışkan pedi, aralarında iki santimetre mesafe olacak şekilde bir Petri kabının tabanına yapıştırın.Bir cam çubuğu pedlerden birinin merkezine yerleştirin. Yapışkan ped, kılcal boruları sabit tutar ve cam çubuk, hazırlanan kılcal boruları destekleyerek uçlarının kırılmasını önler. Bir milimetre dış çap ve 0,78 milimetre iç çapta borosilikat cam kılcal borular kullanılmıştır.Bir kılcal boruyu iğneye yerleştirin, kılcal boruyu nazikçe sabitleyin ve ısıtma filamentinin merkezinde yer alacak şekilde konumunu ayarlayın. Kılcal borular her iki uçtan sıkıca tutulana kadar kelepçeleri nazikçe sıkın. Burada gösterilen önceden tanımlanmış programı kullanarak kılcal boruyu çekin.Ancak, çekici programlama sürecinin deneme yanılma yoluyla ilerlediğini unutmayın. Kabul edilebilir bir uç şekli elde edilene kadar, çekilen her kılcal boru iki adet nihai şekilli kılcal boru oluşturur. Çekilen kılcal boruları cihazdan çıkarın ve uçları kontrol edin; deforme olmuş veya kırılmış olanları atın.Kılcal tüpleri Petri kabına yerleştirmek için küt uçlu konumlandırma cımbızlarını kullanın. Kılcal tüplerin tabanı yapışkan pede tutturulmalı ve üst kısmı uçları yukarı bakacak şekilde cam çubuğa yaslanmalıdır. Petri kap dolana kadar kılcal tüpleri çekmeye devam edin.10 santimetre çapındaki bir kaba yaklaşık 80 kapiler sığar. Ardından, kapilerleri altınla kaplayın. Plakayı altın spütter kaplama cihazına yerleştirin.Gaz beslemesinin üretici talimatlarına göre seçildiğinden emin olun ve önceden tanımlanmış bir kaplama döngüsünü etkinleştirin. Kapillerler eşit şekilde altın rengi alana kadar kaplama işlemi üç ila altı kez tekrarlanır. Kapillerler hazır olduğunda, kütle spektrometresini kalibre etme işlemine geçin.MultiPro kompleksleri üzerinde yürütülen deneylerin çoğu, yüksek kütleler için modifiye edilmiş Waters giriş sistemine sahip, şu anki gibi bir Elektrospray quadruple time of flight kütle spektrometresi ile gerçekleştirilir. Protein örneğini yüklemeden önce, kütle spektrometresini sezyum iyodür kullanarak kalibre edin.Öncelikle, saflaştırılmış su içerisinde 100 mg/mL konsantrasyonunda bir sezyum çözeltisi hazırlayın; sezyum, yüksek kütle kalibrasyonu için kullanılır. Tek yüklü tuz kümeleri, 393 m/z'den 10.000'in çok üzerine kadar uzanan geniş bir kütle aralığına yayılır. Küt uçlu cımbızlar kullanarak Petri kabından kaplamalı bir kapiler alın ve kapilere iki µL sezyum çözeltisi yükleyin.Einor jel yüklü bir uç kullanın. Çözeltiyi, manuel olarak veya bir santrifüj adaptörü kullanarak kılcal borunun ucuna doğru kaydırın. Kılcal boruyu kılcal boru tutucusuna yerleştirin ve ucun tutucunun kenarından yaklaşık 10 milimetre uzakta olacak şekilde ayarlayın.Kılcal boruyu bir optik mikroskop altına yerleştirin ve ucunu düzeltmek için ince uçlu AA tipi cımbızlar kullanın. Kılcal boru içerisinde akışı engelleyebilecek hava kabarcıkları olmadığının ve borunun tıkalı olmadığının doğrulanması önemlidir. Ayrıca, altın kaplamanın kılcal borudan soyulmadığından emin olun.Eğer öyleyse, kapilerle değiştirin veya uç kısmını kırparak kaplanmamış bölümü uzaklaştırın. Ardından, kapiler tutucuyu nano akışlı ESI arayüzüne bağlayın. Kapilerle zarar vermemek için XY, Z tablasını geriye doğru döndürün ve tablayı etkinleştirilmiş konumuna itin.Kılcal tüp, kon orifice'inden 1 ila 10 mm mesafeye yerleştirilmelidir. Sprey başlayana kadar kılcal voltaj ve düşük nano akış basıncı uygulayın. Ardından, nano akış basıncını minimum değere düşürmeye çalışın.XYZ tablasının konumu, kapiler voltajı, nano akış basıncı ve desolvasyon gaz akışı ayarlanarak sinyal yoğunluğunu optimize edin. Geniş bir kütle aralığındaki sezon pik serilerini saptamak için hızlandırıcı voltajlar optimize edilmelidir. Burada kullanılan parametreler; kapiler için 1.3 ile 1.7 kilovolt, örnek konisi için 80 ile 150 volt ve nazik desolvasyon koşulları gerektiren yüksek kütleli iyonların iletimini optimize etmek için ekstraksiyon konisi için bir ile üç volttur.Kaynak ile analizör arasındaki ilk vakum aşamasında arka basınç beş ila altı milibara yükseltilir. Arka basıncı yükseltmek için, sinyal yoğunluğu üzerindeki etkisini izlerken izolasyon valfini kısmen kapatarak kaynak vakum hattının scroll pompaya olan iletkenliğini dikkatlice azaltın. Kütle spektrometrelerinin kurulumu tamamlandığında, 1000 ile 15.000 arasındaki bir ana yük oranı aralığında saniyede bir tarama olacak şekilde yaklaşık 30 tarama toplayın; veri toplama işleminden sonra uçuş süresini uygun kalibrasyon tablosunu kullanarak kalibre edin.Kalibrasyon tamamlandığına göre, protein örneği yüklenebilir. Örnek, kütle spektrometresi kalibre edilmeden önce hazırlanır; düşük mikromolar konsantrasyonlar gereklidir. Gerekirse, santrifüj ultrafiltrasyon cihazlarını kullanarak örneği konsantre edin.Kullanımdan önce protein kompleksinin cihaz membranına absorbe olmadığını doğrulayın. Sadece hacim ve UV absorbansı kontrol edilerek uçucu çözeltiler NESI için kullanılabilir, bu durum genellikle tampon değişimini gerekli kılar. Tuzların, tampon moleküllerinin veya diğer uçucu olmayan tüm addüktlerin kalıntılarını gidermek için bir mikro santrifüj jel filtrasyon kolonu kullanılabilir.Bunun yerine, örneği süspansiyon haline getirin. Sulu bir amonyum asetat çözeltisi kullanın. Bu kritik adım, spektrumların kalitesini belirler.Maksimum değişim sağlanana kadar, cihaz başına 1,3 faktöründen daha az olacak şekilde minimum seyreltme ile tampon değişimi işlemini üç kez tekrarlayın. Hem konsantrasyon hem de tampon değişimi gerekiyorsa, bunlar bu bölümün başında gösterildiği gibi santrifüj ultrafiltrasyonu kullanılarak birlikte yapılabilir. Ardından, numuneyi sezyum iyodür kalibrasyonunda gösterildiği gibi yükleyin ve püskürtmeyi başlatın.Sinyal tespit edilene kadar spreyin ilk optimizasyonunu yaparak başlayın. M'nin kompleksin kütlesi olduğu, ortalama yük durumu için gösterilen denklemi kullanın. Bununla birlikte, Dalton cinsinden yük durumlarının kesin konumu proteine bağlıdır.Kompleks ayrışmasını önlemek için demir kaynağını ısıtmayın. Isıtıcıyı kapatın veya sıcaklığı 40 °C'nin altında tutun. Kılcal boru konumunu, örnek konisi ve ekstraktör voltajlarını değiştirin.Demir iletimini maksimize etmek için olası bir başlangıç noktası, kon voltajı 100 volt ekstraktör konu, bir volt ve kapiler voltajı 1,5 kilovolt şeklindedir. Spektumlardaki meydana gelen değişikliği kontrol edin. Desolvasyonu iyileştirmek ve kalıntı su ile tampon bileşenlerini uzaklaştırmak için bu parametreleri nano akış basıncı ile kombinasyon halinde optimize edin.Çarpışma hücresindeki gaz basıncında bias voltajını artırın. Tipik bias voltajları, dakikada 1 ila 10 mililitre tuzak gaz akışı ile 10 ila 100 volt aralığındadır. Kompleksin birleşmesini önlemek için bu işlemi dikkatli bir şekilde gerçekleştirin, tuzak ve transfer çarpışma enerjilerini ayarlayın.Yüksek kütleli iyonların iletimi için genellikle 10 ile 30 volt arasındaki daha yüksek voltajlar gereklidir. Bu noktada, burada gösterildiği gibi kompleksin çarpışma kaynaklı disosiyasyonundan kaçınmak önemlidir. Kararlı bir sinyale ulaşıldıktan sonra, stabil spreyi korurken nano akış basıncının ve kapiler voltajın minimum değerlere düşürülmesi önerilir.Birkaç tarama topladıktan sonra, tandem kütle spektrometrisi ile kompleksin bileşenlerini tanımlama işlemine geçin. Protein kompleksi için optimum ve stabil bir sinyal elde edildiğinde, bir öncül iyon seçin ve izolasyon genişliğindeki kütle merkezini ayarlayın. Genel olarak, 12'lik düşük kütle çözünürlüğü ve 13 ile 15 arasındaki yüksek kütle çözünürlüğü için; yüksek kütleli düşük yüklü parçalanma ürünlerini tespit etmek amacıyla geniş bir kütle aralığı kullanın ve ardından ms gerçekleştirmek için bu aralığı istenen değerlere düşürün.MS, öncül demiri ayrıştırır. Çarpışma enerjisini (kısaltması CE) ve çarpışma hücresindeki basıncı artırarak, ya tuzak ya da transfer CE'sini kademeli olarak 10 ila 20 voltluk adımlarla artırın ve çarpışma gazı basıncını dakikada sıfır ila beş mililitreye yükseltin. Optimal aktivasyon koşullarına ulaşılana kadar spektrumlardaki değişimleri izleyin. Yüksek aktivasyon enerjisi, sağlam kompleksten bir veya daha fazla alt birimin ayrışmasını tetikleyebilir ve farklı alt birimlerin etkileşim afinitelerini netleştirebilir.ms MS analizi için birden fazla yük seçin. Üst üste binen bileşenlerin olduğu durumlarda, bir dizi tandem MS spektrumunun elde edilmesi, farklı popülasyonların yük serilerinin çözümlenmesine yardımcı olur. Ayrıca, daha yüksek yük durumları, düşük yük durumlarına kıyasla daha kolay ayrışır; MS ve ms spektrumlarını üst üste getirin.Seçilen öncül iyonun izolasyonunu doğrulamak için MS spektrumları. MS ve ms/MS ile bütün kompleksin karakterizasyonuna ek olarak, ms/MS hafif denatüre edici koşullar altında çözeltide daha küçük alt kompleksler oluşturur ve bunları da karakterize eder.Alt komplekslerin MS ve ms MS analizleri, kompleksin alt birim mimarisini tanımlamanın temelini oluşturur; alt birimler arası etkileşimlerin kısmi olarak bozulması için, konsantrasyon %50'ye ulaşana kadar kademeli olarak organik çözücüler ekleyin veya çözeltinin pH'ını amonyak veya formik asit ekleyerek %4 konsantrasyona kadar değiştirin. Son olarak, kompleksi oluşturan bireysel alt birimlerin kütlelerini belirlemek için, denatüre edici koşullar altında spektrum elde etmek önemlidir. Bu işlem, %1 formik asit içeren %25 ila %75 su-asetonitril oranlı bir elüsyon çözücüsü ile zip tip C4 kullanılarak gerçekleştirilebilir; toplanan tüm veriler, ekteki yazılı protokolde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde işlenir ve sonuçlar analiz edilir. Protein kompleks örneği yüklenmeden önce, kütle spektrometreleri sezyum iyodür kullanılarak kalibre edilir.Kırmızıyla işaretlenmiş eşit aralıklı pik serisi, 393'ten 10.000'in çok üzerine kadar geniş bir ana yük oranı aralığına yayılmaktadır. Bunlar, genel kompozisyonu sezyum artı kompleksi olan tek yüklü tuz kümelerine atanmıştır. Siyahla işaretlenmiş ana pikler arasındaki ek sinyaller, sezyum iki artı kompleksi ve sezyum üç artı kompleksi serisinin çift ve üç yüklü türlerinden kaynaklanmaktadır.Yüksek kütleli kümelerin saptanabilmesi için başlangıç vakum aşamasındaki basıncın artırılması gereklidir. Basıncın yüksek kütleli pikler üzerindeki etkisi, burada 1,2 ve 5,3 millibar'lık basınç geri okumalarıyla gösterilmiştir. Daha yüksek basınç için elde edilen kütle spektrumu burada genişletilmiş olarak sunulmuştur.Burada, 3000 ile 5.000 kütle-yük oranı arasında bir yük durumu dağılımı veren bir lektin varyant kompleksinin kütle spektrometrisi örneği görülmektedir. Ancak, iyonların yeterince giderilmemesi nedeniyle pikler geniştir. Hızlandırma koşullarında artış sağlayan biyas voltajının dört volttan 15 volta çıkarılması, kalıntı su ve tampon bileşenlerinin uzaklaştırılmasını sağlayarak yüksek çözünürlüklü bir spektrum üretir; ölçülen kütle pentamerik bir komplekse karşılık gelmektedir.Ardından, tandem MS analizi için +15 yük durumu seçildi. Çarpışma enerjisindeki artış, 1,664 kütle/yük oranı merkezli yüksek yüklü bir monomerin ve 5,000 ile 8,000 kütle/yük oranı aralığında soyulmuş bir tetramerik kompleksin salınmasına neden olur. Lektin varyant kompleksi, kompleks birlikteliğine yol açan denatüre edici koşullar altında da incelendi.Bu sayede, kompleksi oluşturan bireysel alt birimlerin kesin kütlesi belirlenebilir. Size yüksek kütleli iyonların MS ve tandem MS spektrumlarının nasıl elde edileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, numunenin uygun şekilde hazırlanması ve yalnızca kütle spektrometrisi ile uyumlu volatilite tamponlarının kullanılması önemlidir.İşte hepsi bu. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

analyzing-large-protein-complexes-by-structural-mass-spectrometry

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İyon hareketliliği-kütle spektrometresi ve çarpışma kesiti ve kitle dayalı, iyonlar ayıran yeni ortaya çıkan bir gaz faz teknolojisi. Yöntemi protein komplekslerinin genel topoloji ve şekil üç boyutlu bilgi sağlar. Burada, araç ayarı ve optimizasyonu, sürüklenme kez kalibrasyon, ve verilerin yorumlanması için temel bir prosedürü anahat.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Doğru kütle ölçüm proteinlerin soruşturma sırasında önemli bir adımı temsil etmektedir. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometresi (MS) gibi tespiti için kullanılabilir ve önemli avantajı tuzları, deterjan ve kirleticilere karşı tolerans. Burada MALDI-MS ile 100 kDa'dan daha büyük proteinlerin analizi için erişilebilir bir yaklaşımı göstermektedir.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Tarif edilen karşılaştırmalı nicel proteomik yaklaşım, farklı koşullar altında multiprotein komplekslerinin bileşimi içine bir bakış açısı elde etmeyi amaçlamaktadır ve genetik olarak farklı suşların karşılaştırılması ile gösterilmiştir. Kantitatif analiz için bir sükroz yoğunluk gradyanı farklı fraksiyonların eşit hacimleri kütle spektrometresi ile analiz edilir ve karıştırılır.

Multiprotein kompleksleri Karşılaştırmalı Analizi için Yeni Bir Yaklaşım dayanarak<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabolik Etiketleme ve Kantitatif Kütle Spektrometre

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Protein kompleksleri onların fonksiyonu için temel bir mimaridir. Çeşitli kitle spektrometrik teknikleri birleştirerek kendi derleme çalışması için güçlü olduğunu kanıtladı. Biz kimyasal cross-linking ve yerel kütle spektrometresi protokolleri sağlamak ve nasıl çoklu alt birim protein derlemeler mimarisini aydınlatmak için tamamlayıcı bu teknikleri yardımcı göstermek.

Kimyasal Cross-linking ve çoklu alt birim Protein derlemeler mimarlık okumak için olduğu gibi Protein kompleksleri kütle spektrometresi birleştirme

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Kütle spektrometrik tespiti ile dietilptirokarbonat bazlı kovalent etiketlemenin gerçekleştirilmesi için deneysel prosedürler açıklanmıştır. Dietilpyrokarbonat, solvent erişilebilir amino asit kalıntılarının değiştirilmesine yol açan, ilgi çekici protein veya protein kompleksi ile basitçe karıştırılır. Modifiye kalıntılar proteolitik sindirim ve sıvı kromatografisi/kütle spektrometresi analizinden sonra tanımlanabilir.

Kütle Spektrometresi ile Protein Yüksek Sıralı Yapısını incelemek için Diethylpyrocarbonate ile Kovalent Etiketleme

Öğrenin, yapısal kütle spektrometresi kullanarak büyük protein komplekslerinin yapısını ve bileşimini nasıl karakterize edeceğinizi. Bu yöntem, alt birim etkileşimlerini ve kompleks mimarisini anlamak için güçlü bir araç sunar.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Daha fazla video keşfet