Name: İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-06T19:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Öğrenin, insan hücrelerinde gama radyasyonuna yanıt olarak γH2AX fokuslarını immünofloresan yöntemiyle nicelendirin. Bu hassas analiz, DNA hasarı ve onarım süreçlerini değerlendirmek için radyasyon biyolojisinde güvenilir bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Avustralya Nükleer Bilimi ve Mühendisliği Enstitüsü destek kabul edilmektedir. TCK AINSE ödül layık görüldü. Epigenomic Tıp Laboratuarı, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (566.559) Avustralya tarafından desteklenmektedir. LM Melbourne Araştırma (University of Melbourne) ve Biyomedikal Görüntüleme CRC ek burs tarafından desteklenmektedir. Monash Micro Görüntüleme desteği (Dr Stephen Cody ve Iska Carmichael), bu iş için çok değerli idi.

Hücre Hazırlık <ol><li> 37, epidermal büyüme faktörü, sığır hipofiz ekstresi ve 20 mg / ml gentamisin ile desteklenmiş ° C ve% 5 CO 2; İnsan keratinositler (FEP-1811) (Invitrogen K-SFM) keratinosit Serum Ücretsiz Orta yetiştirildiği. </li><li> Tripsin-EDTA (0.05% v / v) ile ayırarak, tek bir hücre süspansiyonu hazırlanmıştır </li><li> Hücreler 8-iyi Lab Tek II microchamber slaytlar ekilirler (10.000 hücrelerinin / iyi) ve slaytlar, 37 ° C'de ve% 5 CO 2 3 gün inkübe edildi . </li></ol> Işınlama <ol><li> Hücreler 137 Cs kaynak (Nordion Uluslararası, ON, Kanada; 20.6 saniye / Gy Gammacell 1000 Elite ışınlama) kullanarak 2 Gy ile buz üzerinde ışınlanmış </li><li> Işınlanmamış kontrolü ve 2 Gy ışınlanmış hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2 'de 1 saat inkübe edildi. </li></ol> Immünofloresan boyaması <ol><li> Medya kapalı uçlu ve hücreler başına 300μl PBS (w / o Ca 2 + veya Mg 2 +) ile yıkanmış ve 5 dakika boyunca bir orbital karıştırıcı döndürüldü. </li><li> Tampon kapalı uçlu ve paraformaldehid her bir kuyunun eklendi ve slaytlar için oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi taze hazırlanmış% 4 (v / v) 100μl oldu. Tüm inkubasyon nemlendirilmiş bir boyama çukur yapıldı </li><li> Hücreler daha sonra PBS (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) ile yıkandı. 5 dakika için bir yörünge karıştırıcı bir Coplin kavanoz ve döndürülebilir Slaytlar yerleştirildi. Bu yıkama adımı iki kere daha tekrarlandı. </li><li> Tampon kapalı uçlu ve aşırı PBS hafifçe lekelenen. </li><li> Hücreler 100ml Triton X-100 (0.1% v / v) başına ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon kullanarak permeabilize. </li><li> Hücreler PBS ile yıkandı (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) adım 3 ve 4 yukarıda açıklandığı gibi. </li><li> Non-spesifik protein bağlanma, oda sıcaklığında ve 20 dakika inkübasyon başına 100 ml (% 1 v / v) BSA ile bloke edildi. </li><li> Aşırı BSA kapalı uçlu ve 100μl Birincil fare monoklonal anti-fosfor-H2AX histon antikor (% 1 BSA, 1:500 sulandırılmış; Millipore), oda sıcaklığında 1 saat inkübasyon için her kuyuya eklendi. </li><li> Hücreler PBS ile yıkandı (w / o Ca 2 + veya Mg 2 +), 3 ve 4 yukarıdaki adımları açıklanan ve ikincil antikor 100μl (Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG ile inkübe% 1 BSA, 1:500 seyreltilmiş ; Invitrogen) karanlıkta, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca iyi ortalama. (Antikor Seyreltilmiş prosedür boyunca karanlıkta tutulmuştur) </li><li> Hücreler PBS ile yıkandı (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) adım 3 ve 4 yukarıda açıklandığı gibi. Ancak, ışığa maruz folyo kullanılarak en aza indirildi. </li><li> De ortalama ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon, Nükleer counterstaining 100ml TOPRO3 (Invitrogen 1:500 seyreltilmiş) ile yapıldı </li><li> Hücreler PBS (w / o Ca 2 + ve Mg 2 +) ile yıkandı 10 yukarıda adımda açıklandığı gibi. </li><li> Odaları dikkatle slaytlar çıkarıldı, aşırı nem, lekelenen ve slaytlar kuru hava için izin verildi. </li><li> ALTIN ​​anti-fade çözüm (Invitrogen) uzatmak Bir damla başına eklendi ve slaytlar monte edildi (22x50 mm lamel) ve slayt kenarlarında herhangi bir aşırı sıvı lekelenen oldu. </li><li> Slaytları oje ile sızdırmazlık önce oda sıcaklığında bir 30 dakika daha karanlıkta tutulmuştur. </li><li> Slaytlar gecede 4 saklandı ° C analizden önce karanlıkta. </li></ol> Mikroskopi / Analiz <ol><li> (- Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG γH2AX) ve (TOPRO 3) uzak kırmızı lazerler Zeiss LSM510 Meta Konfokal Microscpe standart GFP kullanarak görüntü elde etmek için kullanılır. Tipik olarak, 63 x immersiyon yağı objektif lens kullanılır. Görüntüler bir adım boyutu 0,5 mikron ile Z-serisi bir desen elde edilir. Çekirdekleri farklı düzlemlerde odakları mevcut kaybını en aza indirmek için bir adım boyutu 0,5 mikron seçildi. Analizi sırasında, bireysel uçakları deconvoluted ve odakları örtüşme (Top-şapka filtre uygulanan) en aza indirmek için azami Yansıtılan görüntüyü üretmek için yığılmış. </li><li> Metamorph (Moleküler Cihazlar, ABD) odaklarının sayısı analiz etmek için kullanılır oldu. Bu program arka plan dışlamak için eşik uygulandıktan sonra, her hücrede odaklarının sayısı quantitates. Bilgi, daha fazla analiz için bir Microsoft Excel kaydedilir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 γH2AX odakları (yeşil), tedavi edilmezse insan keratinositler ve 2 Gy ile ışınlanmış ve 37 1 saat daha inkübe hücrelerinde İmmünofloresan görselleştirme ° C,% 5 CO 2 . DNA TOPRO-3 (mavi) ile boyandı. Görüntüler Zeiss LSM 510 Meta Konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Bar = 10 mm. e_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/1957/1957fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, insan keratinositler ve 2 Gy ile ışınlanmış ve 37 1 saat daha inkübe hücrelerinde γH2AX odakları (yeşil) İmmünofloresan görselleştirme ° C,% 5 CO 2 . Görüntüler tüm odakları satın sağlamak için 0,5 mm Z-kesit (1-9) kullanarak Zeiss LSM 510 Meta Konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi. Görüntüler daha sonra Metamorph kullanarak kantitatif için yığılmış. DNA TOPRO-3 (mavi) ile boyandı. Yığılmış γH2AX ve mavi görüntüleri görünüm için yığılmış. Bar = 10 mm.

<ol><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma+H2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gamma H2AX and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (12), 957-967 (2008).</li>
<li>Savic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Dynamic+%5Bgamma%5D-H2AX+Domains+along+Broken+DNA+Strands+Is+Distinctly+Regulated+by+ATM+and+MDC1+and+Dependent+upon+H2AX+Densities+in+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of Dynamic [gamma]-H2AX Domains along Broken DNA Strands Is Distinctly Regulated by ATM and MDC1 and Dependent upon H2AX Densities in Chromatin.</a> Molecular Cell. 34 (3), 298-310 (2009).</li>
<li>Downs, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+chromatin-modifying+activities+to+phosphorylated+histone+H2A+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Binding of chromatin-modifying activities to phosphorylated histone H2A at DNA damage sites.</a> Mol Cell. 16 (6), 979-990 (2004).</li>
<li>Chowdhury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5D-H2AX+Dephosphorylation+by+Protein+Phosphatase+2A+Facilitates+DNA+Double-Strand+Break+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">[gamma]-H2AX Dephosphorylation by Protein Phosphatase 2A Facilitates DNA Double-Strand Break Repair.</a> Molecular Cell. 20 (5), 801-809 (2005).</li>
<li>Nakada, S., Chen, G., Gingras, A., Durocher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PP4+is+a+gamma+H2AX+phosphatase+required+for+recovery+from+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">PP4 is a gamma H2AX phosphatase required for recovery from the DNA damage checkpoint.</a> EMBO Rep. 9 (10), 1019-1026 (2008).</li>
<li>Altaf, M., Auger, A., Covic, M., Côté, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connection+between+histone+H2A+variants+and+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Connection between histone H2A variants and chromatin remodeling complexes.</a> Biochem Cell Biol. 87 (1), 35-50 (2009).</li>
<li>Kusch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+by+Tip60+Is+Required+for+Selective+Histone+Variant+Exchange+at+DNA+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Acetylation by Tip60 Is Required for Selective Histone Variant Exchange at DNA Lesions.</a> Science. 306, 2084-2087 (2004).</li>
<li>Hurlin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+human+papillomavirus+type+18-immortalized+human+keratinocytes+to+a+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (2), 570-574 (1991).</li>
<li>Dickey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+functional+roles+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">H2AX: functional roles and potential applications.</a> Chromosoma. , Forthcoming (2009).</li>
</ol>

(Γ-ışınları) iyonize radyasyon, hızla γH2AX odakları formu ve odaklar numaraları için aşağıdaki maruziyet 30-60 dakika 2 ila maksimum ulaşır. Bu nedenle, 1 saat ışınlama sonrası bir zaman noktasında ilk DSB oluşumunu yansıtmaktadır. Biz deneyimiz için klinik olarak anlamlı bir radyasyon dozu 2 Gy kullandık. Ancak, yöntem ilk DSB oluşumu tespiti için 4 Gy radyasyon dozları için kullanılır; odakları önemli bir örtüşme yüksek dozlarda doğru kantitatif engellemektedir. ΓH2AX odakları ölçülebilir numaraları, onarı...

<table><tbody><tr><td>Keratinosit-Serumsuz Besiyeri (K-SFM)</td><td>Besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td>17005042</td><td>İnsan rekombinant Epidermal Büyüme Faktörü 1-53 (EGF 1-53) ve Sığır Pitüiter Ekstraktı (BPE) ile desteklenmiş keratinosit besiyeridir.</td></tr><tr><td>Lab Tek lI Chamber Slides (8-well)</td><td>Kamara Lamları</td><td>Nalge Nunc international</td><td>NUN154534</td><td></td></tr><tr><td>Lamella (22x50mm)</td><td>Lamella</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CS2250100</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Her türlü spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için BSA (%1) kullanılır. Primer ve sekonder antikorlar BSA içinde dilüe edilir.</td></tr><tr><td>PBS (Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; ve Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; içermeyen)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>17-517Q</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA x10</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15400-054</td><td>Hücreleri kültür flasklarından ayırmak için Trypsin-EDTA (%0.05) kullanılır.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Hücreleri permeabilize etmek için Triton X-100 (%0.1) kullanılır.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>Hücreleri fikse etmek için Paraformaldehit (%4) kullanılır.</td></tr><tr><td>Mouse monoklonal anti-fosfo histon-H2AX antikoru</td><td>Primer Antikor</td><td>EMD Millipore</td><td>16193</td><td>Primer antikorun %1 BSA içindeki dilüsyonu (1:500).</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Sekonder Antikor</td><td>Invitrogen</td><td>11029</td><td>Sekonder antikorun %1 BSA içindeki dilüsyonu (1:500).</td></tr><tr><td>TOPRO3</td><td>DNA Boyası</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td>Sık kullanılan DNA boyası: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Yalnızca uygun eksitasyon lazerine sahip mikroskoplarda kullanılabilir.</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Sönme önleyici solüsyon</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>20&amp;#x00B0;C'de 1.42 kırılma indisi.</td></tr><tr><td>Doku Kültür Flaskı, Havalandırmalı Kapak</td><td>Kültür Flaskı</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültür Kabı (150x25mm)</td><td>Petri Kabı</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Kavanozu, cam</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>1771-OG</td><td></td></tr><tr><td>Boyama Havuzu</td><td></td><td>Grale Scientific P/L</td><td>V1991.99</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000 Elite Işınlayıcı</td><td>Gama Işınlayıcı</td><td>Nordion International Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 Meta Konfokal</td><td>Konfokal Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İyonlaştırıcı radyasyon cevabı γh2ax foci kantitasyonu

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Endojen metabolik süreçleri ya da ya da dışsal kaynaklar tarafından indüklenen DNA çift iplikli sonları (DSBs), hayatta kalma ve genomik bütünlüğünün korunması açısından en kritik DNA lezyonlar vardır. DSBs indüksiyon erken bir cevap γH2AX oluşturan, son derece korunmuş C-terminal SQEY motifi, serin-139 kalıntı H2A histon varyant, H2AX fosforilasyon.<sup&gt; 1</sup&gt;. DSBs indüksiyonu takiben, H2AX hızla fosfatidil-inosito 3-kinaz (Pikk) proteinleri aile, ataksi telenjiektazi mutasyona uğramış (ATM), DNA-protein kinaz katalitik subunit ve ATM ve RAD3 ilgili fosforile (ATR)<sup&gt; 2</sup&gt;. Tipik olarak, sadece birkaç baz çifti (bp) kromatin, DNA hasarı sinyalizasyon ve onarımı konusunda değişiklikler önemi göz önüne alındığında, ancak, önemli bir sinyal amplifikasyonu var, bir DSB sorumlu tutulmaktadır. H2AX fosforilasyonu DSB başına toplam hücresel H2AX yaklaşık% 0.03 etkileyen, ağırlıklı olarak kromatin bitişik alanlarda ATM yayılır aracılı<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Bu kolayca görüntülenebilmekte ve immünofloresan mikroskobu ile quantitated DSB ve ayrık γH2AX odaklarının oluşmasına sonuçları site çevreleyen kromatin ~ 2 MBP bölgeleri kapsayan yaklaşık 2000 H2AX molekülleri fosforilasyon karşılık gelen<sup&gt; 2</sup&gt;. DSB az γH2AX kaybı onarım yansıtır, ancak DSBs komple tamir tanımlar ne gibi bazı tartışmalar var, ancak her iki DNA ipliklerini rejoining yeterli olduğunu ileri sürülmüştür, o da öne sürülmüştür yeniden takiben eski haline orijinal sıkıştırma kromatin devlet gerekli<sup&gt; 4-8</sup&gt;. ΓH2AX disappearence en azından bir kısmını içerir fosfatazlar, fosfataz 2A ve fosfataz 4C tarafından Defosforilasyon<sup&gt; 5,6</sup&gt;. Ayrıca, tekrar dağıtılmasıyla γH2AX kaldırılması H2A.Z histon döviz içeren suçlanmıştır.<sup&gt; 7,8</sup&gt;. Önemlisi, γH2AX odakları kantitatif analizi, tıp ve nükleer araştırma uygulamaları geniş bir yol açmıştır. Burada ilk DNA hasarı γ-ışınlanmış yapışık insan keratinositler γH2AX odaklarının tespiti ve kantitatif değerlendirilmesi için en sık kullanılan immünofloresan yöntemi göstermektedir<sup&gt; 9</sup&gt;.

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

Endojen metabolik süreçler veya ekzojen kaynaklar tarafından indüklenen DNA çift zincir kırıkları (DSB'ler), en kritik DNA...

Merhaba, ben Baker Eye, DI Heart and Diabetes Institute'deki Dr. Tom Caris yönetimindeki Epigenomik Tıp Laboratuvarı'ndan Ian Ma. Şu anda, çift zincirli kırılmaların moleküler markörü olan Gamma H two A X üzerinde radyasyonun etkilerine güçlü bir şekilde odaklanan doktora çalışmalarımı yürütüyorum. Bugün, insan hücrelerinde gama radyasyonuna yanıt olarak Gamma H two A expo'nun miktar tayini üzerine bir deney sunacağım.Bu immün boyama protokolü, hem başlangıç DNA hasarını hem de DNA onarımını izlemek için kullanılabilir. Bu yöntem, potansiyel radyasyon modifiye edici bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için de yararlıdır. Örneğin, DNA hasarını artırması beklenen radyosensitize ediciler, daha yüksek sayıda gamma H2AX odakları ile sonuçlanırken, radyoprotektörler DNA çift zincir kırılmalarındaki azalma nedeniyle daha düşük sayıda odak saptanmasıyla ters etki gösterecektir.Şimdi deneye başlayalım. Bu deneyde kullanılan hücreler, her kuyucukta 10.000 hücre olacak şekilde hazne lamlarda hazırlanan insan sitositleridir. Lamlar, radyasyon öncesinde üç gün boyunca 37 °C'de %5 karbondioksit ortamında inkübe edilir.Taşıyıcı 2D iradyatörü buz üzerinde dilimleyin, ardından kontrol lamlarını

quantification-of-h2ax-foci-in-response-to-ionising-radiation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA çift iplikli tatili yanıt Ser-139 H2AX fosforilasyon aşağıdaki formu γH2AX odakları, mikroskobik analiz radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada çekirdeğin içinde radyasyona bağlı γH2AX oluşumu uzamsal dağılımını değerlendirmek için, aktif transkripsiyonu ökromatin bir epigenetik işaretleyici olarak mono-metil histon H3 lizin 4 antikor kullanılır.

Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Fare dalak lenfositlerinde kronik in vivo düşük doz ışınlamanın neden olabileceği DNA hasar seviyelerindeki ve DNA onarım kapasitesindeki değişiklikleri, DNA çift sarmallı kırılmaların bir belirteci olan fosforile histon H2AX'i ölçerek, akış sitometrisi kullanarak değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

Çift iplikli kırılmalara DNA tamiri lezyon ele sonra sadece onarım kompleksleri, tatili, aynı zamanda onların çözünürlük oluşumu gerektiren dinamik bir süreçtir. Burada, ayirt mikroskobu geçici ve uzun ömürlü çift iplikçikli tatili için bir araç olarak bu genom bakım mekanizma incelemek için kullanırız.

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu protokol, periferik kan lenfositleri üzerinde γ-H2AX odak analizinin slayt hazırlanmasını ve otomatik puanlamasını sunar. Tahlil yöntemini ve hassasiyetini göstermek için, izole lenfositler in vitroışınlandı. Dna DSB algılamanın bu otomatik yöntemi, hızlı ve yüksek verimli biyolojik dozimetri uygulamaları için yararlıdır.

İnsan Periferik Kan Lenfositlerinde γ-H2AX Odak Analizi için Otomatik Mikroskobik Puanlama Yöntemi

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Öğrenin, insan hücrelerinde gama radyasyonuna yanıt olarak γH2AX fokuslarını immünofloresan yöntemiyle nicelendirin. Bu hassas analiz, DNA hasarı ve onarım süreçlerini değerlendirmek için radyasyon biyolojisinde güvenilir bir araçtır.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

Daha fazla video keşfet