Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Hücre metabolizmasını ve işlevlerini düzenleyen mekanizmaları anlamak için canlı hücrelerdeki moleküllerin etkileşim ağını çözmek özel bir öneme sahiptir. Kalitatif ve kantitatif bilgi sağlayan, sayısı giderek artan metodolojiler, hücre işlevlerinin bütünsel resimlerini elde etme yolundaki itici gücü oluşturmaktadır. Co ip, TAP tag veya foto çapraz bağlama deneyleri, öncü moleküllerin in vitro ortamda saflaştırılmasına olanak tanır.

Ek olarak, canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin analizi için çeşitli yaklaşımlar tasarlanmıştır. Bunlar arasında iki hibrit tarama veya floresan proteinlerin komplementasyon deneyleri yer almaktadır. Ayrıca, bu sorunu ele almak için FRET veya FCS gibi bazı spektroskobik yaklaşımlar ve spektroskobik olmayan yöntemler geliştirilmiştir.

Söz konusu teknikler geniş hücre popülasyonlarının kaydedilmesi için geliştirilmiştir, ancak oldukça dolaylı olmaları ve bu nedenle neredeyse hiç kantitatif olmamaları nedeniyle sorun teşkil etmektedir. Buna karşılık, birkaç üst düzey kantitatif yaklaşım tanıtılmıştır. Ancak, yüksek kapasiteli veri toplama yeteneklerini kantitatif bilgi çıkarma imkanıyla birleştirmek, yüksek verimliliği genişletmeyi zorlaştırmaktadır.

Yakın zamanda protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için yeni bir konsept geliştirdik. Buradaki mikro desenleme tekniği, BSA Sci beşin fonksiyonelleştirilmiş cam lamel üzerine basıldığı mikro desenli SA ızgaralarının şematik bir gösterimidir ve ara boşluklar önce streptavidin, ardından biyotinize ligandlar ile doldurulur. Çoğu durumda, membrana karşı antikorlar kullanılır.

Bu tür mikrobiyom çipleri üzerinde büyütülen hücrelerdeki protein yemi. Yem, antikor mikro desenine göre plazma membranında düzenlenecektir. Floresan işaretli ikinci bir protein avı ile olan etkileşimler, ortak desenleme derecesi ölçülerek incelenir. Belirli özellik boyutu ve derinliğe sahip karelerden oluşan bir dizi içeren silikon master PDMS damga kullanılarak gerçekleştirilir.

Üç mikrometrelik parçalar bir jelden üretilir ve kesilip çıkarılır. Damgalar, önceden %100 etanol ve çift distile su ile durulanır ve nitrojen ile kurutulur. Ardından 0,67 mg/mL sci-fi ile inkübe edilirler.

İnkübasyon sırasında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca işaretli BSA çözeltisi ile bekletilir; epoksi modifiyeli cam lamel örtüler de aynı şekilde temizlenir. Mürekkepleme işleminden sonra damgalar, aynı şekilde PBS ve su ile yıkanır. BSA sci beş transferi için.

Bir damga azot ile kurutulur ve hemen ardından 30 dakika boyunca bir cam lamelin altına kendi ağırlığıyla yerleştirilir. Mikro desen alanının konumu, lamelin arka yüzüne işaretlenir. Damgalar kaldırıldıktan sonra, lameller yapışkan silikon maskelerle mühürlenir.

Odacıklar, bir saat boyunca inkübe edilen 50 µg/mL Streptavidin çözeltisi ile doldurulur ve ardından bir mililitre PBS ile durulanır. Sonrasında, streptavidin desenleri bir saat boyunca 10 µg/mL biotinize antikor ile inkübe edilir ve PBS ile yıkandıktan sonra odacığa hücreler yüklenir. Hücreler yüzeye tutunduğunda, örnek ölçümler için hazır hale gelir.

Okuma işlemi için tek gereksinim, örneği toplam iç yansıma konfigürasyonunda aydınlatabilen bir floresan mikroskobudur. Bu tür sistemler farklı tedarikçilerde ticari olarak mevcuttur ve son yıllarda kullanıcılar için yönetimi kolay hale gelmiştir. Bizim tespit sistemimiz bir epi-floresan mikroskop üzerine kurulmuştur.

Kullanılan floroforların seçici floresan eksitasyonu için argon ve kripton iyon lazerleri kullanılır; numuneler, 100 kat büyütmeli, yüksek NA'li bir yağ daldırma objektif kullanılarak objektif tabanlı bir toplam iç yansıma konfigürasyonunda aydınlatılır. Standart filtre setleri kullanılarak yapılan uygun filtrelemenin ardından, floresan bir arka aydınlatmalı CCD kameraya görüntülenir. Okuma işlemi, geniş numune alanlarının taranmasına olanak tanıyan zaman gecikmeli entegrasyon modunda gerçekleştirilir. Bunun için numuneler, kameranın satır kaydırmasıyla senkronize edilmiş motorlu bir XY tablası kullanılarak kaydırılır.

Geri yansıyan lazer ışını, iki segmentli bir fotodiyota görüntülenir ve diferansiyel sinyal, hızlı yeniden odaklama için bir Z pizo kontrolünde kullanılır. Okuyucu, tarama işlemi sırasında çalışan otomatik bir odak tutma sistemiyle donatılmıştır; bu işlemde ilk tarama GFP'nin seçici uyarımı için 488 nanometrede, ikinci tarama ise PS Five'ın seçici uyarımı için 647 nanometrede gerçekleştirilir. Veri analizi için, yakalanan antikor bölgesinin içindeki ve dışındaki floresan yoğunluğuna dayalı, MATLAB ile yazılmış bir kontrast hesaplama programı kullanıyoruz.

Çok sayıda hücrenin hızlı analizi için kontrast seviyesi ve dolayısıyla protein etkileşim derecesi analiz edilir. Ayrıca ticari olarak mevcut olan otomatik yazılımlar da kullanılabilir. Örneğin, Olympus tarafından sunulan scan R görüntüleme yazılımı, mikro desenleme deneylerinin kontrast değerlendirmesi için başarıyla test edilmiştir.

Burada gösterildiği gibi, erken T-hücresi sinyalizasyonundaki proteinlerden CD four ve LCK arasındaki iyi bilinen etkileşimi analiz ediyoruz. Floresan LCK, CD four antikorla kaplanmış bölgelerdele açıkça yeniden dağılmaktadır. Bir çinko şelatör eklenmesiyle bu iki proteinin ana etkileşim bölgesi olan çinko kenet yapısının bozulması, daha sonra LCK mikro desenlerinin kontrastını azaltmaktadır.

Özetle, mikro desenleme tekniğinin temel avantajları şunlardır: yerel olarak uzaysal çözünürlüğe sahip protein etkileşimlerinin nicelenmesi. Ayrıca, canlı hücrelerin plazma membranındaki zayıf etkileşimlerin saptanması, modüle edilmiş yem-av (bait-prey) etkileşimlerinin tespiti, dinlenme durumunun analizi ve yaklaşımın yüksek kapasiteli tarama için uygulanabilirliği.