JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyoloji
0 görüntüleme • 2:53 dk • April 30th, 2023
-Gelişmekte olan pupaya erişmek için, pupa epiteli kütikülden ayrıldıktan sonra veya pupa evresi P5'ten sonra puparyumu çıkarın. Başlamak için, sağlam pupayı ventral tarafı size bakacak şekilde yerleştirin. Puparium'u kasanın ön ucu ile pupa'nın başı arasındaki boş alanda tutmak için forseps kullanın. Ardından, başı ortaya çıkarmak için puparyumun ön parçasını nazikçe kırın ve çıkarın.
Ventral oryantasyonu korurken, pupariumun ön-arka ekseni boyunca küçük kırılmalar oluşturmak için forsepsleri kullanın ve süreçte sürekli bir boşluk oluştuğundan emin olun. Doğrudan altındaki pupa dokusuna zarar vermemeye dikkat edin. Daha sonra puparyumu boşluktan dışa doğru, her seferinde bir parça olacak şekilde kırmaya devam edin ve bu süreçte yırtık muhafazayı yayın. İnce bir ıslak boya fırçası kullanarak, daha fazla araştırma için açıkta kalan pupayı alın. Örnek protokolde, Drosophila guttifera'nın puparyumunun nasıl çıkarılacağını ve pupa'nın görüntüleme için nasıl hazırlanacağını göreceğiz.
-Puparium çıkarmaya başlamak için, bir parça kağıt havlu üzerine bir parça çift taraflı bant yapıştırın. Pupa'yı ventral tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bandın üzerine yerleştirin. Pupariumun ön tarafı ile iç pupa arasındaki boşluğu bulun. Forseps kullanarak bu boşluğun etrafındaki puparyumu kavrayın ve çıkarın ve pupanın başının ön tarafını ortaya çıkarın.
Bir forsepsin ucunu ön-arka eksene paralel hareket ettirerek yerleştirin. Puparium'u yerel olarak kırmak için forsepsin ucunu kaldırın. Kırılma pupariumun arka kısmına ulaşana kadar bu işlemi tekrarlayın. Puparium ve pupa bacakları arasında bir boşluk oluştuğundan emin olun ve iç pupaya verilen hasarı en aza indirirken puparyumun ventral tarafını kırın. Puparium'u mümkün olduğunca kırdıktan sonra ince bir boya fırçası kullanarak pupayı çıkarın. Pupayı ddH2O ile nemlendirilmiş ve plastik bir Petri kabına yerleştirilmiş bir kağıt mendil üzerine yerleştirin. Açıkta kalan pupa savunmasız olduğu ve kolayca kuruduğu için hemen fotoğraf çekin.