Drosophila Oyuk Açma ve Tünel Açma Deneyi: Sinek Larvalarında Doku Hipoksisini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

- Embriyo toplama kafesini kurmak için, taze maya macunu ile desteklenmiş üzüm suyu agar plakaları kullanın ve plakaları uygun genotipe sahip erkek ve dişi Drosophila sinekleri içeren kafeslere yerleştirin. Maya ve üzüm suyundan gelen koku çekicidir ve dişiler tarafından yumurtlamayı teşvik eder. Belirli bir süre boyunca yumurtlamaya izin verin. Daha sonra yetişkinleri çıkarın ve ilk instar larvalarını elde etmek için embriyo plakalarını 24 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, üzüm suyu tabağından birkaç ayrı larvayı, plakanın ortasındaki agarda bir deliğin kesildiği ve maya ezmesi ile doldurulduğu, yalnızca agar test plakasına nazikçe aktarın.

Genç larvaların gelişmesi için vücut ağırlığını kazanmak için beslenmeleri gerekir, bu nedenle besin kaynağı olan maya macununda yuva yaparlar. Larvalar geliştikçe, dolaşma aşamasına girerler ve pupa için bir yer aramak için yiyeceklerden uzaklaşırlar. Hipoksiyi değerlendirmek için, substratta larvaların oluşturduğu tünel desenlerini inceleyin. Tünel açma eksikliği veya yetersizliği, oksijen yoksunluğunun bir işaretidir. Örnek protokolde, oyuk açma ve tünel açma testinin nasıl kurulacağını göreceğiz.

- Metin protokolünde açıklandığı gibi yumurta yumurtlama kaplarında kontrol ve deneysel genetik çaprazlamaları ayarlayın. Zamanlanmış yumurta toplamaya başlamadan önce sinekleri en az iki gün karanlıkta tutun. Zamanlanmış yumurta toplama için, yetişkinleri günün erken saatlerinde taze bir maya ezmesi ile süslenmiş yeni üzüm agar plakalarına aktarın ve yetişkinlerin dört saat boyunca tabaklara yumurta bırakmasına izin verin. Dört saat sonra yetişkinleri taze üzüm agar plakalarına aktarın.

Daha sonra, dört saatlik toplama plakalarını gece boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi öğleden sonra, larvaların çoğu yumurtadan çıkmış olacak. Her deney grubu için en az 50 deney grubu olmasını planlayın.

Tahlilin tek bir çalışması için, deney grubu başına en az beş tahlil plakası hazırlayın. Isıtılarak 700 mililitre deiyonize suya 16 gram sinek agar ekleyin. % 95 etanol içinde 17.5 mililitre Nipagen hazırlayın. Agar çözeltisini neredeyse tamamen eriyene kadar ısıtın. Daha sonra agar çözeltisine Nipagen çözeltisi ekleyin ve agar tamamen eriyene kadar ısıtın. Agar çözeltisini kısa bir süre soğutun, ardından 15 mililitre agar çözeltisi ile 10 santimetre plaka yükleyin. Agar jelleştikten sonra, plakaların kapaklarını kapatın ve birkaç saat veya gece boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın.

Kürlenmiş agar dokunulduğunda sağlam olmalı ve parçalar kesildiğinde parçalanmaya karşı direnç göstermelidir. Agar sertleştikten sonra, her plakadaki agar jelinde merkezi bir delik açmak için 1,5 santimetrelik bir mantar delici kullanın. Daha sonra delikleri taze maya ezmesi ile düzgünce doldurun.

Larvaları tahlil plakasına aktarmak için basit bir alet yapın. Plastik bir mikrospatulanın ucuna bir eğri bükün ve ucu larvalara yapışması için maya macununa batırın. Şimdi ilk instar larvalarını tek tek toplayın ve onları yiyecek höyüğüne yakın agar tabağına yerleştirin. Her deney grubu için, her biri 10 larva içeren en az beş tabak hazırlayın.

Test tekrarları arasında tekrarlanabilirliği sağlamak için, her bir test plakasına sadece 10 larva yerleştirilmesi çok önemlidir. Mikrospatula ucuyla her larva verdiğinizde bir ve yalnızca bir larva aktarıldığını belirlemek için test plakasını dikkatlice kontrol ettiğinizden emin olun.

Plaka yüklendikten sonra etiketleyin, üzerini örtün ve ardından kapak tarafı yukarı bakacak şekilde oda sıcaklığında karanlıkta yerleştirin. Tüm larvalar ölene veya pupa olana kadar her plakayı günlük olarak inceleyin. İşte tahlilin ikinci gününden sekizinci gününe kadar vahşi tip bir suş için plaka örnekleri. İkinci günde, larvalar yiyeceğe gömülür ve tünel açılmaz. Tünel açma üçüncü günde başlar ve larvaların dolaşmayı bırakıp tünellerinde pupa olmasıyla beşinci ve sekizinci günler arasında maksimuma ulaşır.

Pupaları bükülmüş bir alay iğnesi ile dikkatlice bir üzüm tabağına aktarın ve istenirse kaç pupanın birbirine yaklaştığını sayın. Pupa oluşumunu not edin ve pupaları anormallikler açısından değerlendirin.