Name: Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-12T17:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde esiRNA kullanarak yüksek verimli RNAi tarama yöntemini. Hücre döngüsü düzenlenmesinde görevli genleri belirlemek için optimize edilmiş transfeksiyon koşulları ve istatistiksel analiz tekniklerini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz tartışma için Buchholz laboratuar ve Sigma-Aldrich RNAi ekibi üyeleri kabul etmek istiyorum. Max-Planck-Society ve Bundesministerium für Bildung und Forschung grands destek için [0315105]-Bio teşekkür etmek istiyorum. MİSYON ® Sigma-Aldrich Biyoteknoloji LP tescilli markasıdır.

1. Yüksek kaliteli MİSYON esiRNA kütüphaneler <ol><li> Ilgi her gen için DEQOR algoritma (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) kullanan RNAi için en duyarlı ve spesifik bir hedef bölge seçilen 4 DEQOR puanları tüm susturma potansiyeli state-of-sanat tasarım kısıtlamaları 4 dayalı bir hedef-mRNA mümkün 21 nükleotidler uzun siRNA&#39;lar. Buna ek olarak, her bir potansiyel siRNA okudu organizmanın transcriptome karşı BLAST arama yaparak diğer genlerin olası çapraz reaktivite açısından analiz edilir. Bu program, böylece genel kalitesi ve potansiyel esiRNA (300-600 bp uzunluğunda) çapraz susturulması kapasiteleri bir analiz sağlar. </li><li> CDNA hedef genin seçtiğiniz bölge bakteriyofaj RNA polimeraz-organizatörü dizileri ile çevrili gen-spesifik primerler kullanılarak PCR ile yükseltilir. </li><li> MİSYON esiRNA üretimi için kullanılan her bir PCR ürünü kaliper Labchip analiz, sıralama tarafından kimlik ve saflık doğrulandı. </li><li> Uzun çift iplikli RNA, RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ipliklerini tavlama takip PCR ürün transkripsiyonu. </li><li> esiRNAs Q-sepharose dönüş sütunlarını kullanarak anyon değişim kromatografisi ile saflaştırılması tarafından takip RNaseIII kullanarak uzun çift iplikli RNA sınırlı enzimatik sindirimi tarafından hazırlanmıştır. </li><li> esiRNAs çöktürülmüş ve TE tamponunda yeniden süspanse. Verimi UV-emme ölçümleri ile ölçülür ve konsantrasyonu TE tamponu uygun bir hacim içinde eriterek ayarlanır. Nihai ürünün genel kalitesini kaliper Labchip analizi ile kontrol edilir. </li></ol> 2. Bir hücre hattı seçimi ve tarama için optimize transfeksiyon <ol><li> Titre esiRNA (pozitif ve negatif kontrol olarak renilla lusiferaz olarak kullanılması Eg5) ve 384 plaka transfeksiyon reaktif miktarları artan miktarda, hücre ve 48 saat süreyle inkübe ekleyin. Eg5 bipolar mili montaj ve tükenme için gerekli bir kinesin motor proteindir mitotik tutuklanmasına yol açar. Farklı transfeksiyon ayıraçları ve hücre hatları için bu yordamı tekrarlayın. Burada, transfeksiyon reaktif gibi standart prosedürler ve oligofectamine (Invitrogen) kültürlü HeLa hücreleri kullanır. </li><li> Optimal transfeksiyon koşulları seçimi için bir mitotik arrest (yuvarlak) ve renilla lusiferaz (RLUC) esiRNA ışık mikroskobu ile transfekte hücrelerin toplam sayısı gösteriyor Eg5 esiRNAs transfekte hücreler sayılır. RLUC için en az toksisite ve Eg5 için en belirgin fenotip durumu seçin. Transfeksiyon koşulları optimize etmek için alternatif bir yöntem EGFP (veya uygun başka bir muhabir geni) kurucu aktif organizatörü kontrol altında ifade istikrarlı bir hücre hattı içerir. EGFP (veya başka bir muhabir geni) ve RLUC (veya başka bir uygun negatif kontrol esiRNA) örneğin floresan destekli cep sıralama (FACS) ile ölçü knock-down etkinlik ve toksisite karşı esiRNA transfeksiyon sonra. EGFP için kullanılan esiRNA hedef mRNA tamamen tamamlayıcı olduğundan emin olun. </li></ol> 3. İlköğretim ekran 5,6 Kurma <ol><li> Pipetleme doğruluğu otomatik pipetleme istasyonu (örneğin, Kova, Tecan ve WellMate, Matrix) tüm bileşenleri için optimize edin. Pipetleme parametreleri çözüm, hacim ve plaka tipi türüne bağlı olarak değişir Bu nedenle optimizasyon her adımı için ayrı ayrı tekrarlanmalıdır. Mümkünse, pipetleme istasyonu Bulaşmayı önlemek için laminer akış kaputun altında yer olmalıdır. Tüm kullanılan bileşenler varsa otoklavlanarak veya% 75 etanol ile püskürterek birini kullanmadan önce sterilize edilmelidir. Kuyudan çapraz kontaminasyon hariç böylece yıkama protokolleri optimize edin. Optimizasyonu için otomatik pipetleme Ayrıntılar alan kısıtlamaları vermek ve büyük ölçüde kullanılan pipetleme istasyonu bağlı olamaz. Daha fazla bilgi için protokol üretmektedir bakın. </li><li> Eg5 ve RLUC esiRNAs yukarıda optimize koşulları kullanarak 384-well formatında Transfect hücreleri. Eg5 ve RLUC esiRNA için bütün plaka kapsayan bir alternatif desen kullanın. </li><li> 48 saat inkübasyon soğuk% 100 etanol ile hücreleri düzelttikten sonra, 1 mcg / ml DAPI ve 100 mg / ml RNaz A (Qiagen) içeren PBS ile 25 dakika leke, 15 dakika süreyle PBS içinde rehidrate. Son olarak 4 PBS ve mağaza ile yıkayın ° C </li><li> DAPI-floresan mikroskopi örneğin Olympus ScanR sistemi Tedbir yoğunluğu. Hücre sayısı karşı DAPI yoğunluğu planladığı bir histogram oluşturun ve G1-faz için DNA içeriği 2N hücrelerin yüzdesi hesaplanarak hücre döngüsü dağıtım değerlendirmek; &lt;2N&gt; S-faz için 4N; G2/M-phase için 4N &gt; anöploidi / poliploidi 4N. </li><li> Homojenliği plaka üzerinde sonuçları değerlendirin. Konum effe dışlamak için önemli bir farklılık daha fazla optimizasyon gereklicts. Çok iyi plakaları kullanarak yaygın bir sorun, inkübasyon süresi sırasında kenar kuyularında gelişmiş buharlaşma. Bu genellikle plaka pozisyonu belirli etkileri çevirir farklı kuyular, farklı deneysel koşullar yol açar. Bu nedenle, boş bir ekran için tüm kenar kuyular terk tavsiye ederiz. Daha sonra buharlaşma inkübatörler yüksek nem muhafaza emin olun en aza indirmek için. Ayrıca rutin buharlaşma blok Corning Nefes Sızdırmazlık Tape gibi buharlaşma engelleri istihdam. Ayrıca diğer kaynaklar konumunu etkiler, göz okuma sistemi örneğin teknik varyasyonu (mikroskop, plaka okuyucu, vb.) Ya da sıvı taşıma varyasyonlar (degradeler, homojen çözüm, vb) içine alınmalıdır. </li><li> Pozitif ve negatif kontroller arasında istatistiksel farklılık istihdam edilen testin önemi bir ölçü sağlar. Negatif kontrol (veya arka plan gürültüsü, mock-kontrol) arasında büyük bir fark ve örnek gerçek tarama başlatmadan önce kurulmuş olması gerekir. Istatistiksel anlamlılık için iyi bir önlem Z-faktördür. Z-faktör denklemi aşağıdaki şekilde hesaplanır: Z = 1 - (3 SD [örnek] + 3 SD [alay]) * (| Av [örnek] - Av [alay] |) -1 SD: standart sapma, ortalamanın Av. A dan Z ye 1-faktör&gt; Z&gt; 0.5, negatif kontrol, pozitif kontroller 7 istatistiksel olarak anlamlı bir ayırma (gürültü) gösterir . </li></ol> 4. Birincil ekran <ol><li> Yukarıdan optimize koşullar kullanan esiRNAs transfeksiyon 384-iyi doku kültürü tabak hazırlayın. Burada, her iyi 5μl TE tampon içinde çözünmüş 15ng esiRNA kullanın. Plaka başına en az sekiz kontrol pozisyonları incelenen biyolojik bir süreç için uygun pozitif ve negatif kontroller (Eg5 ve RLUC) yüklü olmalıdır. Kenarına kuyu önlemek konumunu etkiler sadece 5μl TE tamponu ile yüklenir. </li><li> 5μl OptiMEM (Invitrogen) yanı başına 0.2μl Oligofectamine içeren ekleyin, karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. </li><li> 72 saat hücre süspansiyonu ve inkübe;: (1000 hücre başına eşdeğer bir HeLa hücre süspansiyonu 25 hücre / ml konsantrasyonu 40μl) transfeksiyon karışımı üzerine ekleyin. </li><li> Otomatik bir mikroskop (Olympus ScanR, yukarıya bakınız) DNA içeriği ölçün. Z-skoru, referans olarak negatif kontrol için sinyal kullanarak tüm numune esiRNAs hesaplanır: isabet seçim Z-skoru istatistikleri kullanarak değerlendirin. Not, Z-skoru Z-faktör olarak aynı değildir. Z-skoru (sahte) kontrol ile karşılaştırıldığında istatistiksel bir ölçüsüdür örnek değerler önemi sağlar. Bu denklemi şu şekilde hesaplanır: Z = (değer [Örnek] - ortalama [alay]) * standart sapma [alay] -1. Hit seçimi için bir eşik uygulanmak zorundadır. Tipik olarak, bir önemi kriterler: 2 &lt;Z &lt;-2, ancak veri kalitesine bağlı olarak, biyolojik bir süreç ya da sadece ekran kapsamında incelenir, farklı eşikleri geçerli olabilir. Oldukça kolay Z-skoru istatistikleri yanı sıra aynı zamanda daha ayrıntılı matematiksel değerlendirme yöntemleri kullanılabilir (tarama verilerinin istatistiksel değerlendirme geniş bir alana ilk iç Malo et al bulunabilir 8 ). </li></ol> 5. İkincil ekran ve hit doğrulama <ol><li> İkincil ekran nedeniyle yanlış pozitif deneysel hatalar ya da off-hedef etkilerini ortadan kaldırmak için birincil ekran izler. Seçilen hit için birincil ekran olarak kullanılan aynı prosedürü daha iyi bir istatistik değerlendirme izin çoğaltır, daha büyük bir sayı (3-5) tekrar edilmelidir. </li><li> Doğrulanmış hit için ilk ekranlarında belirlenen hedeflere karşı ikincil bir örtüşmeyen esiRNA (veya başka bir örtüşmeyen susturulması tetik) kullanılmalıdır. Aynı tahlil ve okuma-out birincil ekran olarak uygulanmalıdır. </li><li> Sonuçta seçilen genler, türler arası RNAi kurtarma 9 doğrulanabilir . Böylece örneğin bir bakteri geni fare orthologunu yapay kromozomu (BAC) kodlama stably hücrelerine transfekte. BAC-genomik bağlamda bir gen yapıları korumak ve neredeyse fizyolojik bir ifade için izin. Endojen insan gen karşı RNAi RNAi-fenotip kurtarır fare transgen ifadesi değişmeden bırakacaktır. RNAi-kurtarma, bugüne kadar RNAi fenotipleri doğrulanması için altın standart sağlar. </li><li> Son olarak, doğrulanmış adaylar sonunda mekanistik anlayış elde etmek için daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. Birçok durumda RNAi ikincil, daha ayrıntılı testlerin, örneğin, bu deneylerde kullanılan olabilir. </li></ol>

<ol><li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+silencing+RNAs%3A+an+expanding+universe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li>
<li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li>
<li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li>
<li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEQOR%3A+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li>
<li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+mammalian+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li>
<li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar sunulan iş bir ilgi olabilir ticari kuruluşlar ile mali ilişkileri beyan ederim.

RNA girişim-fonksiyon kaybı fenotipleri incelemek için standart bir teknik haline gelmiştir. RNAi mediatörlerin Büyük ölçekli koleksiyonları farklı tedarikçilerden mevcuttur ve gen susturulması için kolay, maliyet-etkin ve hızlı bir yöntem sağlamak. Bu farklı türler ve hücre türleri geniş bir yelpazede bir genom ölçekli bir bakış açısı sağlayan birçok biyolojik süreçlerde anahtar oyuncular için sistematik tarama için kapı açtı. Yüksek yanlış pozitif ve yanlış negatif oranları RNAi ekranlarında ortak bir meydan okuma. Bu sorunu çözmek için, etkinliğini artırmak için önemli çabalar yatırım ve özellikle de sessizliğini özgüllüğü tetikler edilmiştir. Önemli bir keşif aynı transkript hedefleyen farklı siRNA&#39;lar bir havuz hedef özgüllüğü büyük ölçüde artırdığını oldu. Çok karmaşık, farklı siRNA&#39;lar bir havuz endoribonuclease tarafından üretilen olduğundan, esiRNAs RNAi ekranlarında yalancı pozitiflik oranı azaltmak, yüksek hedef özgüllüğü tetikler. esiRNAs aynı zamanda da yanlış negatif oranının azaltılması, etkili knockdowns ulaşmak için göstermiştir. RNAi ekranları teknik olarak zor olduğundan, muhtemelen bir süre için bir rutin olarak gerçekleştirmek zor kalacaktır. Ancak, reaktifler ve araçlar daha iyi ve daha laboratuvarlar kendi uzmanlık pay almak, modern biyolojinin RNAi ekranların kullanımı gelecekte artırmak için kabul edilir.

<table><tbody><tr><td>MISSION esiRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Ek bilgi için iletişime geçin: rnai@sial.com</td></tr><tr><td>Wellmate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geçirgen sızdırmazlık bandı</td><td>Corning</td><td>Geçirgen Sızdırmazlık Bandı, Steril (Ürün #3345)</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=E7023%7CSIAL&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Etanol&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof (absolüt), moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=P5493%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Fosfat tamponlu salin&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>BioReagent, 10x konsantre, hücre kültürü için uygun, moleküler biyoloji için</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=D8417%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&amp;#8242;,6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun, &amp;gt;98% (HPLC ve TLC)</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=R6513%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Sığır pankreasından Ribonükleaz A&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Moleküler biyoloji için, &amp;#8805;70 Kunitz ünitesi/mg protein, liyofilize toz</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;amp;N4=T9285%7CSIGMA&amp;amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;amp;F=SPEC&amp;amp;cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA tampon çözeltisi&lt;/a&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100 x, moleküler biyoloji için</td></tr></tbody></table>

memeli hücreleri rnai tarama mİsyon esirna

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA enterferans (RNAi) gen ekspresyonunun kontrolü için temel bir hücresel mekanizmadır. RNAi küçük müdahale RNA&#39;lar (siRNA) olarak da bilinen kısa çift iplikçikli RNA&#39;lar tarafından indüklenir. Kısa çift iplikçikli RNA&#39;lar Dicer, endonükleazları RNaz III ailesinin bir protein aktivitesini daha uzun çift zincirli öncüleri kaynaklanır. Çıkan parçaları cognate hedef mRNA yönetmenlik, RNA-indüklenmiş susturulması kompleksi (RISC) bileşenleridir. RISC böylece kodlanmış protein 1,2,3 ifade azaltılması hedef mRNA parçalayarak. RNAi küçük müdahale RNA&#39;lar kullanan memeli hücrelerinde gen fonksiyon testleri kaybı için güçlü ve yaygın olarak kullanılan deneysel bir yöntem haline gelmiştir. Şu anda küçük müdahale RNA&#39;lar üretimi için iki ana yöntem mevcuttur. Bir yöntem, alternatif bir yöntem in vitro RNaz III hedef özgü uzun çift iplikçikli RNA&#39;lar endonucleolytic bölünme istihdam ise kimyasal sentez içerir. Böylece, siRNA-benzeri çeşitli bir havuz oligonükleotidler endoribonuclease hazırlanmış siRNA veya esiRNA olarak da bilinir üretilir. Kimyasal olarak elde edilen siRNA&#39;lar ve esiRNAs etkinliğinin karşılaştırılması, her iki tetikler hedef gen susturulması güçlü olduğunu gösterir. Özgüllüğü karşılaştırarak zaman Farklılıklar, ancak tanık olabilir. Birçok tek kimyasal olarak sentezlenmiş siRNA&#39;lar esiRNAs doğasında karışım daha spesifik bir demonte 10 yol açar ise, önde gelen off-hedef efektler üretir. Bu çalışmada, genom-ölçekli MİSYON esiRNA kütüphaneleri ve hücre döngüsünün ilerlemesi alan genlerin belirlenmesi için DNA içeriği ekran örneklediği RNAi tarama için kullanımı tasarım mevcut. Biz transfeksiyon protokolü ve yüksek verimlilik tarama testinin nasıl optimize göstermektedir. Biz de istatistiksel olarak değerlendirildi, ne kadar büyük olabilir veri setlerini göstermek ve birincil hit doğrulamak için yöntemler mevcut. Son olarak, valide vurur daha fazla fonksiyonel nitelendirmeler için potansiyel başlangıç ​​noktalarını verir.

Burada bir insan esiRNA kütüphane ilgili genler hücre bölünmesi için yüksek verimli bir ekran kullanın. Biz nasıl bir esiRNA ekranlarının yanı sıra, sonuçları nasıl analiz etmek ve doğrulamak için kurmak ve yürütmek göstermektedir.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

RNA interferansı (RNAi), gen ekspresyonunun kontrolü için temel bir hücresel mekanizmadır. RNAi, ... olarak da bilinen kısa çift sarmallı RNA'lar tarafından indüklenir.

RNAi ile hücre döngüsü ilişkili genlerin taranması, uygun bir knockdown teknolojisi görevinin seçilmesiyle başlar. Sigma Aldridge'den alınan siRNA kütüphaneleri, endoribonükleaz ile hazırlanan siRNA'ların yüksek etkinliğini ve özgüllüğünü kullanır. siRNA'lar, hedef mRNA'ya tamamlayıcı olan uzun çift sarmal RNA'nın enzimatik sindirimi ile hazırlanan, bireysel siRNA'lardan oluşan karmaşık havuzlardır. Aynı transkripti hedefleyen siRNA'ların havuzlanması, özgüllüğü artırır ve etkin ve özgül bireysel siRNA'ların aranmasıyla uğraşılan zahmetli süreci önler.Bu durum, kolay RNA'yı özellikle büyük ve orta ölçekli fonksiyon kaybı taramaları için uygun hale getirir. Burada, yüksek verimli transfeksiyon kurulumundan uygun bir assay geliştirilmesine kadar, büyük ölçekli bir RNA göz taraması gerçekleştirmek için gerekli adımları gösteriyoruz. Bu süreç, memeli hücre döngüsü ilerlemesinde rol oynayan genler için bir tarama kurulumu ile örneklendirilmiştir.İlk olarak, optimize edilmiş şekilde hilar hücrelerinin transfeksiyonu gösterilmiş, ardından assay kalitesinin istatistiksel değerlendirmesi yapılmıştır. Son olarak, hedef gen eksiltme sonrası hücre döngüsü dağılımının ölçüldüğü genom ölçekli bir tarama gerçekleştirilmiştir. Hitler zco istatistiği kullanılarak seçilmiş ve ikincil bağımsız easy RNA'lar ile doğrulanmıştır.Ayrıca, RNA göz taramasını takip etmek için kullanılabilecek potansiyel deneysel prosedürleri özetliyoruz. Merhaba, ben Max Planck Moleküler Hücre Biyolojisi ve Genetiği Enstitüsü'nden Ty. Ve ben Tristan.Ben de Dresden'deki Max Planck Enstitüsü'nden Frank Al. Bugün sizlere Sigma Aldridge'in mission easy RNA'larını kullanarak memeli hücrelerde bir fonksiyon kaybı taraması kurma prosedürünü göstereceğiz. RNAi taramasının genleri biyolojik süreçlerle nasıl ilişkilendirebileceğini göstermek için, bir doku kültürü hücresi popülasyonunda hücre döngüsü dağılımını ölçen bir deney örnek olarak kullanılacaktır.Hadi başlayalım. Her RNAi tarama projesi, susturma tetikleyicilerinin seçimiyle başlar; endo ribonükleazla hazırlanan siRNA'lar veya kısaca esiRNA'lar, uzun çift zincirli RNA'ların RNase 3 kullanılarak sınırlı enzimatik sindirimiyle üretilir. Her esiRNA'nın kimliği dizileme ile, saflığı ise Caliper LabChip analizi ile doğrulanır.Hepsi aynı transkripti hedefleyen bireysel siRNA'ların havuzlanması, havuzdaki her siRNA aynı hedefi paylaşırken hedef dışı etkilerin seyrelmesi nedeniyle özgüllüğü artırır. Bu nedenle, easy RNA'lar hedef dışı etkilerden kaçınarak iyi susturma etkinliğine ve yüksek hedef özgüllüğüne sahiptir. Genom ölçekli easy.RNA kütüphaneleri Sigma Aldrich tarafından sağlanmıştır. Kenar kuyucukları boş bırakılmış 384 kuyucuklu plakalar kullanılmıştır. Ayrıca, plakaların merkezindeki sekiz konum kontrol grupları için boş bırakılmıştır.easy RNA alt kütüphaneleri, tüm kuyucukları dolu olan 96 kuyucuklu plakalar halinde sunulmaktadır; müşteriler, easy RNA'ların bu plakalarda nasıl dizileceğine karar verebilirler. Münferit easy RNA'lar tekli tüplerde sağlanır. easy RNA transfeksiyonu, farklı transfeksiyon reaktifleri ve hücre hatları için optimizasyon gerektirir.Standart prosedürlere uygun olarak kültüre edilmiş hücrelerimiz ve transfeksiyon reaktifi olarak oligo kullanılır. Bipolar iğ kurumu için gerekli olan EEG five E-Z-R-N-A-A kinesin motor proteini pozitif kontrol olarak ve ran luciferase easy RNA negatif kontrol olarak kullanılır. 384 kuyucuklu bir plakada, örneğin 1 ng ile 56 ng arasında 5 ng'lık artışlarla farklı miktarlarda easy RNA ve 0,1 µL ile 0,9 µL arasında 0,05 µL'lık artışlarla artan miktarlarda transfeksiyon reaktifi titresini belirleyin.RNA ve transfeksiyon reaktifini karıştırdıktan sonra hücreleri ekleyin ve 48 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresi tamamlandığında, hücreleri bir ışık mikroskobu altında inceleyin. eeg ile transfekte edilmiş hücreleri sayın.Mitotik döneme işaret eden yuvarlak bir şekil gösteren beş kolay RNA. Ayrıca negatif kontrol ile transfekte edilmiş toplam hücre sayısını da sayın. Gran vanilla luciferase kolay RNA.Optimal transfeksiyon koşulu, vanilla lusiferaz için en düşük toksisiteyi ve EEG five için en belirgin fenotipi göstermektedir. Transfeksiyon parametreleri optimize edildiğine göre, kuruluma ve primer taramaya geçiniz. Primer taramaları hazırlamak için kullanılan Matrix Wellm Mate veya Tecan Aquarius gibi otomatik pipetleme istasyonları, kontaminasyonu önlemek için laminer akışlı kabin altına yerleştirilmelidir.Kullanılan tüm bileşenler, kullanım öncesinde, uygunsa otoklavlanarak veya tarama öncesinde %75 etanol püskürtülerek sterilize edilmelidir. Bu cihazlar, üretici protokollerine göre optimize edilmelidir. Pipetleme parametreleri çözelti hacmi tipine ve plaka tipine göre değişiklik gösterdiğinden, otomatik pipetleme istasyonunda kullanılan tüm bileşenler için pipetleme doğruluğu optimize edin.Bu optimizasyon her adım için ayrı ayrı tekrarlanmalıdır. Ek olarak, otomatik pipetleme istasyonları hazır olduğunda, kuyucuklar arası çapraz kontaminasyonun önlendiğinden emin olmak için yıkama protokollerini optimize edin. Herhangi bir konum etkisinin gözlemlenmediğinden emin olmak için, daha önce belirlenmiş optimize edilmiş koşulları kullanarak hücreleri 384 kuyucuklu formatta transfect edin.Tüm plakayı kapsayan dönüşümlü bir düzen kullanarak EEG five için easy RNA'lar ve vanilla lusiferaz kullanın. Çok kuyucuklu plakalar kullanıldığında karşılaşılan yaygın bir sorun, inkübasyon süresi boyunca kenar kuyucuklarda buharlaşmanın artması olduğundan, tüm kenar kuyucuklarını boş bırakın. Bu durum, farklı kuyucuklarda farklı deneysel koşullara yol açar ve bu da genellikle plaka konum etkilerine neden olur; buharlaşmayı daha da en aza indirmek için Corning nefes alabilen tavan bandı gibi buharlaşma bariyerleri kullanın.Ayrıca inkübatörlerin yüksek nemde tutulduğundan emin olun. Ancak, sıvı aktarımı veya plak okuyucu gibi okuma sistemindeki farklılıklar gibi konum etkilerine yol açabilecek olası kaynakların bulunduğunu unutmayın. 48 saatlik inkübasyonun ardından, hücreleri buz gibi soğuk %100 etanol ile iki saat boyunca fikse edin ve ardından 15 dakika boyunca PBS ile rehidre edin.Fikse edilmiş hücreleri, mililitre başına bir mikrogram DPI ve mililitre başına 100 mikrogram RNAs içeren PBS içerisinde 25 dakika boyunca boyayın. Son olarak PBS ile üç kez yıkayın ve dört derece Celsius'ta saklayın. Ardından, DPI floresan yoğunluğunu mikroskopi ile ölçün.Burada her biri için bir Olympus tarayıcı sistemi kullanılmıştır. Hücreler incelenecek ve göreceli DPI yoğunluğu belirlenecektir. Histogram tabanlı olarak, hücre sayısına karşı DPI yoğunluğunu grafiğe dökerek bir histogram oluşturun.Hücrelerin DNA içeriği 2N olanları G1/G0 evresi, 2N ile 4N arası olanları S-evresi, 4N olanları G2/M evresi ve 4N'den büyük olanları anöploidi veya poliploidi olarak hesaplayarak hücre döngüsü dağılımını değerlendirin. Plaka genelindeki sonuçların homojenliğini değerlendirmek için, EEG5 ve lusiferaz transfekte edilen farklı kuyucuklar arasındaki G2/M evresindeki hücre yüzdelerini karşılaştırarak hücre döngüsü dağılımını kıyaslayın; eğer sonuçlar plaka üzerinde önemli ölçüde farklılık gösteriyorsa, konum etkilerini ortadan kaldırmak için daha fazla optimizasyon gereklidir. Sonuçların tutarlılığından emin olduktan sonra, pozitif ve negatif kontroller arasındaki istatistiksel farkları hesaplayın.Sonuçların istatistiksel anlamlılığını belirlemek için burada gösterilen Z faktörü denklemini kullanın. SD standart sapmayı, AV ise ortalamayı temsil eder. Bir ile 0,5 arasındaki bir Z faktörü, negatif kontrollerin ve gürültünün pozitif kontrollerden istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde ayrıldığını gösterir.Böyle bir istatistiksel fark saptandıysa, birincil taramaya geçilebilir. Burada belirlenen optimize edilmiş koşulları kullanarak easy RNA'ların transfeksiyonu için 384 kuyucuklu doku kültürü plakalarını hazırlayın.Kuyu başına 15 nanograms easy RNA, beş microliters TE tamponu içerisinde çözülür. Plaka başına en az sekiz kontrol pozisyonuna, incelenen biyolojik süreç için uygun pozitif ve negatif kontroller yüklenir. Burada EEG five ve ranil luciferase çalışılmıştır.Pozisyon etkilerinden kaçınmak için kolay RNA'lar kullanılır. Kenar kuyucuklarına sadece beş mikrolitre TE tamponu yüklenir. Ardından, her kuyucuğa 0,2 mikrolitre oligo içeren beş mikrolitre opti MEM karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.RNA'yı transfeksiyon reaktifi ile karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunu buraya ekleyin. Mikrolitre başına 25 hücre konsantrasyonunda, kuyucuk başına 1000 hücreye karşılık gelen 40 µL he R hücre süspansiyonu ekleyip 72 saat boyunca inkübe edin. 72 saatlik inkübasyonun ardından.DNA içeriğini, daha önce gösterildiği gibi Olympus scan R gibi otomatik bir mikroskopta ölçün. Hit seçimi için kütüphanedeki tüm plakalar için bu prosedürü tekrarlayın. DNA içeriği değerlerini Z-skoru istatistiklerini kullanarak değerlendirin.Z-skorunun, Z faktörü Z-skoru ile aynı olmadığına dikkat edin. Numune değerinin negatif veya yalancı (mock) kontrolle karşılaştırıldığında anlamlılık düzeyine dair istatistiksel bir ölçüt sağlar. Burada gösterilen denklem takip edilerek hesaplanır.Hit seçimi için negatif vanilya lüsiferaz kontrolünün sinyalini referans alarak tüm kolay RNA örnekleri için zco değerini hesaplayın. Bir eşik değerinin uygulanması gerekir. Tipik olarak, iki'den büyük veya eksi iki'den küçük olan Z değeri için bir anlamlılık kriteri kullanılır. Ancak, incelenen biyolojik sürece veya taramanın kapsamına bağlı olarak farklı eşik değerleri uygulanabilir.Hit seçimi için Q gibi daha ayrıntılı matematiksel değerlendirme yöntemleri de kullanılabilir. Ardından, seçilen hit'ler ikincil bir taramaya ve HIIT doğrulamasına tabi tutulur. Deneysel varyasyondan kaynaklanan yanlış pozitifleri elemek için, seçilen HIIT genlerinin ikincil taraması birincil taramayı takip eder.İlk olarak, seçilen hitlerin doğruluğunu, primer taramadakiyle aynı prosedürü kullanarak doğrulayın; ancak daha iyi bir istatistiksel değerlendirme yapabilmek için hitleri üç ile beş arasında daha fazla tekrar sayısı ile kurun. Doğrulanmış hitler için primer taramadakiyle aynı testi ve okumayı kullanın, ancak ikincil, örtüşmeyen kolay bir RNA veya kimyasal olarak sentezlenmiş bir siRNA gibi başka bir örtüşmeyen susturma tetikleyicisi kullanın. Seçilen genleri nihayetinde türler arası karşılaştırmayla valide edin.RNAi kurtarma, bugüne kadar mevcut olan RNAi fenotiplerinin doğrulanması için altın standarttır. Kısaca, seçilen genin farklı bir türden ortologunu kodlayan ve BAC olarak kısaltılan bir bakteriyel yapay kromozom, hücrelere stabil olarak transfekte edilir. BAC konstrüktleri, bir geni genomik bağlamında korur ve neredeyse fizyolojik bir ekspresyona olanak tanır.Endojen gene karşı uygulanan RNAi, orto transgene ekspresyonunu değiştirilmeden bırakacak ve bu da RNAi fenotipini kurtaracaktır. Son olarak, valide edilen adaylar, nihai olarak mekanistik bir anlayış elde etmek amacıyla daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. Birçok durumda, RNAi bu ikincil ve daha kapsamlı analizlerde de kullanılabilir.Örneğin, RNAi fenotiplerinin zaman geçirmeli mikroskobisi. Burada, insan genomundaki 16.000'den fazla genin knockdown edilmesi sonrası HeLa hücrelerinin DNA içeriğinin ölçüldüğü bir hücre döngüsü taraması örneği yer almaktadır. Hücre bölünmesi için gerekli olduğu belirlenen 1.351 birincil hit tespit edilmiştir.İkincil taramada, 743 hit, ikincil bir analiz kullanılarak bağımsız bir ikincil kolay RNA tetikleyicisi ile doğrulanmıştır. G2 evresinde durmaya neden olan knockdown'lar, mitotik durmaya neden olan knockdown'lardan ayrılmıştır. Son olarak, Lin 54 geninin düzgün hücre bölünmesindeki rolünü doğrulamak için türler arası RNAi kurtarma deneyi kullanılmıştır.Daha sonra yapılan aşağı akış deneyleri, Lin 54 eksikliğinin birçok hücre döngüsü geninin ekspresyonunu değiştirdiğini göstermiştir. İnsan doku kültürü hücre hattında yüksek verimli mission, easy RNA transfeksiyonunun nasıl kurulacağını ve hücre döngüsü dağılımının analizini size göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, transfeksiyon koşullarının ve assaylerin her türlü hücresel sistem ve biyolojik süreç için ayrı ayrı optimize edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir.Özellikle küçük ölçekli taramalar için otomatik sıvı taşıma sistemlerinin kullanımı önerilir ancak zorunlu değildir. Manuel işlem yapmak da mümkündür. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Hedef Kimliği Kütüphane miRNA hedefleri belirlemek için kullanılan klonlanmış cDNA bir plazmid tabanlı, genom koleksiyondur. Burada kullanımı ve uygulama göstermektedir.

MİSYON Hedef Kimliği Kütüphane Kullanımı miRNA Hedefler için genom Ekran

Burada hücre sağkalım teşvik gen hedefleri belirlemek için sıralama yöntemlerini bir insan LentiPlex toplanmış kütüphane ve geleneksel kullanın. Biz kurmak ve deconvolute bir LentiPlex ekran ve sonuçları doğrulamak nasıl göstermektedir.

MİSYON LentiPlex Memeli Hücreleri shRNA Kütüphane Tarama Pooled

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

RIP-Chip aracılığıyla RNA ilişkili kompleksleri izole ve tanımlamak için adım protokolü bir adım.

RIP-Chip kullanarak Hücre Ekstraktlarının gelen mRNA mikroRNA&#39;lar ve ribonükleoprotein Kompleksi Protein Bileşenlerinin İzolasyonu ve Tanımlama için Yöntemi

Bu protokolde, Amaxa Nucleofector 96 kuyulu Mekik Sistemini kullanarak murin makrofaj hücre hatlarını siRNA'larla verimli bir şekilde transfekte etmek, makrofajları lipopolisakkarit ile uyarmak ve inflamatuar sitokin üretimi üzerindeki etkileri izlemek için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Burada, hipoksiye HIF1A aracılı hücresel tepkinin yeni ubikitin ve ubikitin benzeri regülatörleri belirlemek için bir hedef siRNA "ubiquitome" ekranı gerçekleştirmek için bir yöntem tarif eder. Bu raportör etkinliğinin üzerinden sağlam bir okuma kullanılabilir herhangi bir biyolojik yoluna uyarlanabilir.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Bu rapor hücresel miRNAs mRNA hedefleri doğrulamak için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklanır. Sentetik biotinylated miRNA kilitli nükleik asit LNA tabanlı yakalamaya taklit eden yöntemi kullanır mRNA hedef. Daha sonra manyetik boncuklar streptavidin kaplı açılan için istihdam edilmektedir hedef mRNA qPCR polimeraz zincir reaksiyonu tarafından miktar için.

Biotin tabanlı açılan tahlil için Doğrula mRNA hedefleri hücresel miRNAs

SINEUPs çoğu sentetik antianlamlı kodlamayan RNA'ların bir bağlayıcı etki (BD) ve bir efektör etki alanı (ED) içerir ve yukarı düzenleyen-çeviri hedef mRNA. Burada, biz algılama yöntemleri için SINEUPs kültürlü hücre hatları, çeviri teşvik faaliyetlerini Western-blot ve görüntüleme sistemi yarı otomatik yüksek üretilen iş analizini açıklanmaktadır.

Özellikle mRNA çeviri geliştirebilirsiniz RNA'ların kodlamayan SINEUP deneyleri bağlı hücre

Dört plazmidli in vitro hücrelerde kullanılmak üzere bir intronic mikroRNA biyogenez muhabir testi geliştirdik: biri intronic miRNA ile, biri hedefli, biri düzenleyici bir proteini aşırı eksprese etmek ve biri Renilla lusiferaz için. MiRNA işlendi ve hedef diziye bağlanarak lusiferaz ekspresyonunu kontrol edebildi.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

Öğrenin, memeli hücrelerinde esiRNA kullanarak yüksek verimli RNAi tarama yöntemini. Hücre döngüsü düzenlenmesinde görevli genleri belirlemek için optimize edilmiş transfeksiyon koşulları ve istatistiksel analiz tekniklerini keşfedin.

Memeli Hücreleri RNAi Tarama MİSYON esiRNA

Daha fazla video keşfet