JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyoloji
0 görüntüleme • 2:59 dk • April 30th, 2023
- Diseksiyon mikroskobu altında ve serum takviyeli ortamda, üreme sistemini forseps ile her sinekten çıkarın. İlk olarak, üreme sistemine eşlik etmiş olabilecek sindirim sisteminin parçalarını çıkarın. Aksesuar bezleri ve boşalma kanalını izole etmek için testisleri, boşalma ampulünü ve terminaliayı çıkarın. Serumu çıkarmak için dokuyu PBS'de bir ila iki dakika yıkayın. Ardından, ayrışma çözeltisine aktarın.
Bezlerin içindeki hücreleri ayrışma çözeltisine maruz bırakmak için, her bezin merkezini forseps ile tutun ve bezi bir çift keskin forseps ile dilimleyin. Çiftleşmede yer alan proteinleri salgılamaktan sorumlu nadir ikincil hücre popülasyonunu içeren bezlerin distal ucunu geride bırakmak için bezin proksimal kısmını ve boşalma kanalını çıkarın. Son olarak, sindirime hazırlık için aksesuar bez uçlarını bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Aşağıdaki protokolde, transkriptom analizi için ikincil hücreleri izole etmek için aksesuar bezleri inceleyeceğiz.
- Prosedüre başlamadan önce, bezleri tutmak için yuvarlak, geniş 200 mikrolitrelik uçları kesin ve alevlendirin ve açıklıkları daraltmak için birden fazla 1000 mikrolitrelik ucun uç açıklığını bir saniyeden daha kısa bir süre alevin yanından geçirin. Ardından, değiştirilmiş uçları aspirasyon hızlarına göre daha dardan daha genişe doğru sıralayın. Aksesuar bez diseksiyonu için, 20 ila 25 erkek drosophila'yı buz üzerine bir cam tabağa koyun ve bir erkek sineğin üreme sistemini çıkarmak için forseps ve diseksiyon mikroskobu kullanın.
Aksesuar bez çiftini, testisler ve boşalma ampulü de dahil olmak üzere diğer tüm dokulardan temizleyin ve aksesuar bezlerini oda sıcaklığında serum takviyeli ortam içeren bir cam plakaya aktarın. 20 çift aksesuar bezi toplandığında, bezleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika boyunca bir PBS kabında yıkayın. Yıkamanın sonunda, bezleri taze hazırlanmış ayrışma çözeltisine aktarın ve bir bez lobunun ortasını sıkıca sıkıştırmak için diseksiyon mikroskobu altında keskin forseps kullanın.
İkinci bir forseps çifti kullanarak, aksesuar bezin proksimal bölgesini ve boşalma kanalını bezin ikincil hücreler içeren kısmından ayırmak için dokuyu keskin uçla kesin. Ardından, bezleri 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarmak için önceden ıslak alev yuvarlatılmış geniş 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanın.
Bu makale, transkriptom analizi için sekonder hücreleri izole etmek amacıyla erkek Drosophila'nın aksesuar bezlerinin diseksiyonuna yönelik bir protokolü detaylandırmaktadır. Yöntem, ileri çalışmalarda gerekli olan bezleri elde etmek için üreme ve sindirim dokularının dikkatli bir şekilde çıkarılmasını içerir.
Drosophila erkek aksesuar bezi sekonder hücrelerinin hassas diseksiyonu ve izolasyonu, genetik olarak yönetilebilir bir modelde yüksek doğrulukta transkriptomik profilleme sağlar. Bu iş akışı, üreme biyolojisi ve sekresyon yolu araştırmaları için erken aşama hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Yöntemin tekrarlanabilirliği ve hücre tipi özgüllüğü, alt akış fonksiyonel genomik ve tarama uygulamaları için öngörü güvenilirliğini artırır.
Bu diseksiyon ve izolasyon protokolü, erken keşif ve öncü bileşik belirleme aşamalarının kesişim noktasına uygun olup, hedef seçimini ve mekanistik çalışmaları bilgilendiren sağlam hücre tipi spesifik analizlere olanak tanır.
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026