Yetişkin Drosophila Beyinlerinin Montajı: Konfokal Görüntüleme için Slaytlar Hazırlama Yöntemi

- Pozitif yüklü bir mikroskop lamı üzerine, Drosophila beyinlerinin monte edilmesi için bir alan oluşturmak için aralarında yeterli mesafe olacak şekilde iki kapak fişi yapıştırın. Stereo mikroskop altında, beyinleri bu boşluğa montaj ortamında pipetleyin. Dokunun negatif yükü, beynin slaytın yüzeyindeki pozitif yüke yapışmasına yardımcı olacaktır.

Anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzeninde beynin slayt üzerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasına izin vermek için fazla montaj ortamını çıkarın, ardından beyinleri örtmek için üçüncü bir kapak fişi yapıştırarak iki kapak fişini köprüleyin.

Boşluğu doldurmak için, montaj ortamını boşluğun kenarına her seferinde bir damla yerleştirin ve beyinleri rahatsız etmeyecek şekilde kılcal hareketle yayılmasına izin verin.

Boşluğu oje ile kapatın ve lekeli dokuların floresansını korumak için karanlıkta eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Örnek protokolde, immün tipi nöronların konfokal görüntülemesi için Drosophila beyinlerini monte edeceğiz.

- Beyinleri monte etmek için bir köprü kaydırağı oluşturun. İki taban kapağını, pozitif yüklü bir kızak üzerinde yaklaşık bir santimetre aralıklarla yerleştirin. Pozitif yüklü tarafın yukarı baktığından emin olun. Ardından kapak fişlerini oje ile slayta yapıştırın ve devam etmeden önce cilanın tamamen kurumasını bekleyin.

Ardından, slaytı bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve beyinleri kapak fişleri arasındaki boşluğa orta derecede pipetleyin. Beynin görselleştirilmesini iyileştirmek için aydınlatmayı ayarladığınızdan emin olun.

Ardından, beyinlerden kaçınmaya dikkat ederek ekstra montaj ortamını slayttan aspire edin. Ardından, kalan fazla montaj ortamını fitilleyin. Bu, beyinlerin daha hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayacaktır. Şimdi, forseps kullanarak, beyinleri anten lobları yukarı bakacak şekilde bir ızgara düzenine yönlendirin.

Ardından, beyinlerin üzerine bir kapak astarı yerleştirin ve alt kapak fişlerine takılan üst kapak fişinin kenarlarını kapatmak için tırnak cilası kullanın.

Şimdi, orta boşluğu yeni montaj ortamıyla damla damla doldurun ve ortamın kılcal hareket ile kapak kaymasının altına çekilmesine izin verin. Boşluk dolduğunda, şeffaf tırnak cilası kullanarak tamamen kapatın.