Drosophila Nöromüsküler Kavşak (NMJ) Miktar Tayini: Sinaptik Morfoloji ve Fonksiyonu Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

- İlk olarak, NMJ'lerin veya nöromüsküler kavşakların farklı yönlerini vurgulayan belirteçlerle Drosophila larvalarını immünostain. Bu, bir motor nöron aksonunun ucunun bir kas ile temas ettiği bölgedir ve morfolojisi sinaptik fonksiyonun bir okuması olarak kullanılır.

Akson, bouton adı verilen çıkıntılar oluşturan birkaç dalda sona erer. Nörotransmiterler butonlardan salınır ve kas kasılmasına neden olur. Nörotransmitter salınım alanlarına aktif bölgeler denir. Burada bir belirteç, NMJ'yi özetleyen sinaptik bir protein için spesifiktir ve diğer belirteç, aktif bölgelerde bulunan bir protein içindir.

Ardından, mikroskopi kullanarak NMJ görüntülerini elde edin ve yarı otomatik görüntü analiz yazılımı ile morfolojilerini kantitatif olarak değerlendirin. Görüntülere önceden ayarlanmış bir dizi yazılım komutu uygulayın. Çıktı dosyaları, analiz edilen NMJ görüntülerini ve morfoloji sonuçlarını içerir. Ölçülebilen özellikler arasında butonların sayısı ve yüzey alanı, NMJ uzunluğu ve dal numarası, bağlantısız NMJ bölmelerinin sayısı ve aktif bölgelerin sayısı bulunur.

Aşağıdaki örnekte, postsinaptik bir belirteç olan DLG1 ve aktif bir bölge işaretleyicisi olan BRP ile boyanmış Drosophila NMJ'lerin morfolojisini analiz edeceğiz.

- Bu protokol için, NMJ'lerin görüntü yığınlarını oluşturun ve bunları, kanal 1'in DLG1 boyamayı veya benzer bir işaretleyici ve kanal 2'nin BRP boyamayı gösterdiği ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedin. Başlamak için, NMJ görüntü dosyalarının Z projeksiyonlarını ve hiper yığınlarını oluşturun. Eklenti seçeneklerini açın ve Drosophila NMJ morphometrics'i seçin.

Şimdi, mikroskobun TIFF olarak kaydederken görüntü serisine atadığı benzersiz dosya dizesini tanımlayın. Bu, resim adının sonunda olacaktır. En düşük düzleme ve kanal numarasına verilen dizeyi kopyalayıp benzersiz dosya dizesi ayar penceresine yapıştırın. Ardından 'Yığına dönüştür' alt makrosunu seçin ve görüntülerin bulunduğu dizini veya klasörü seçin.

Her görüntü dosyası için, varsayılan yığın ve düz yığın adlarıyla iki yeni dosya oluşturulur ve ardından orijinal görüntü adı gelir. Depolama alanından tasarruf etmek için orijinal dosyalar daha sonra silinebilir. Ardından, Drosophila NMJ morfometri arayüzünden, tanımlanan ROI alt makrosunu seçin ve görüntü dosyası dizinini seçin.

İlk projeksiyon açıldığında, serbest el seçimleri aracını seçin, ardından ilgilenilen tam bir NMJ terminalini içeren bir bölge tanımlamak için fareyi kullanın. Seçildikten sonra, tanımlanan terminal penceresinde Tamam'a tıklayın. NMJ terminalleri tüm projeksiyonlarda tanımlanana kadar bunu yapmaya devam edin. Makro işlemi otomatik olarak ilerletir. Her görüntü dosyası için, varsayılan adlar ROI ve ardından orijinal görüntü adıyla yeni bir dosya oluşturulur.

NMJ özelliklerini ölçmek için önce Drosophila NMJ morfometri arayüzüne gidin ve ölçeği ayarlayın. Örneğin, görüntünün bir pikseli 0,72 mikrona karşılık geliyorsa, ölçek piksellerini 1 ve ölçek mesafesini 0,072 olarak ayarlayın. Ardından alt makro Analizi'ni seçin ve iki kanal görüntüsü varsa, Bekle'yi de değiştirin. Tamam'a basın ve istendiğinde görüntü dosyası dizinini seçin. İşlem süresi sinaps başına birkaç dakika olabilir.

Analizden sonra, analiz edilen her sinaps için yeni görüntü dosyaları ebeveyn klasöründe saklanır ve nicel ölçümler results.txt dosyasındadır. Tüm resimleri inceleyin ve segmentasyon hataları olan resimleri hariç tutun.

Örneğin, sinaptik terminalin parçaları sarı anahatta dahil edilmeyebilir. Arka planın bazı kısımları sinaptik terminale dahil edilebilir. Mavi bir iskelet hattı sinaptik terminalin ötesine uzanabilir. Çok fazla etkin bölge olabilir veya bazı etkin bölgeler algılanmamış olabilir.