JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 4:49 dk. • April 30th, 2023
- Temiz, uyuşturulmuş bir larvayı başı yukarıda olacak şekilde bir cam örtü kızağının altına monte ederek başlayın. Ardından, larvaları yuvarlamak ve konumunu ayarlamak için kapak fişini hafifçe iterek ilgi alanını ortaya çıkarın. Larva sinir hücrelerini bulmak için konfokal görüntülemeyi kullanın. Yaralanma bölgesi olarak hedef nöral hücrelerden birinde belirli bir akson tanımlayın.
Daha sonra hedef aksonu, hasara neden olmak için görüntüleme için kullanılandan daha yüksek bir güçte iki fotonlu bir lazere maruz bırakın. İki fotonlu bir lazer, çevredeki dokuya minimum hasar vererek canlı doku içindeki hasara nüfuz etme ve hassas bir şekilde lokalize etme kabiliyeti nedeniyle kullanılır.
Hedef nöronda hasar olduğunda, aksotomi veya aksonun kopması ile sonuçlandığında lazer maruziyetini derhal durdurun. Son olarak, istenen zaman noktalarında dejenerasyonunu ve ardından rejenerasyonunu görmek için yaralı nöronu görüntüleyin.
Örnek protokolde, mikroskopi için bir larva monte edeceğiz, larva duyusal nöronlarına zarar vereceğiz ve nöral rejenerasyonu izleyeceğiz.
- Larvaları uyuşturarak başlayın. Çeker ocakta, 60 milimetrelik bir cam tabağı 15 santimetrelik plastik bir petri kabına yerleştirin. Sonra bir parça kağıt mendil katlayın ve cam tabağa koyun. Dietil eter eklendikten sonra üzüm agar plakasını doku üzerine yerleştirin.
Ardından, bir cam slayt üzerine ortasına bir damla halokarbon 27 yağı koyun ve dört köşenin her birine bir nokta vakumlu gres yerleştirin. Daha sonra bir larvayı agar plakasına aktarmak için forseps kullanın ve larvaları uyuşturmak için cam tabağı kapatın. Lav hareket etmeyi bırakır bırakmaz, başı dik olacak şekilde dikkatlice halokarbon yağına aktarın. Ardından sürgünün üzerine bir örtü kaydırın ve larvaya değene kadar hafifçe bastırın.
Ardından, iki fotonlu lazerin onlara en kolay çarpacağı yere kesilecek hücreleri yuvarlamak için kapak kaymasını kaydırmak için hafif bir kuvvet kullanın. Konum, hangi nöronların hedeflendiğine bağlı olarak değişecektir. Şimdi düzeneği iki fotonlu mikroskop aşamasına sabitleyin ve 40x yağa daldırma objektifi kullanarak ilgilenilen hücrelere odaklanın.
Yazılımda, tarama moduna geçin ve kaydedilen protokolü yükleyin. İğne deliğinin tamamen açık olduğundan emin olun. Ardından, canlı modda, ilgilenilen bölgenin iyi bir görüntüsünü elde edin.
Ardından, kırpma düğmesinin kullanılabilir hale gelmesi için canlı taramayı durdurun. Kırpma işlevini kullanarak, hedef alanı yalnızca olası yaralanma bölgesine odaklamak için tarama penceresini ayarlayın. Ardından yeni bir görüntüleme penceresi açın. Şimdi tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Ardından, taramayı başlatmak ve durdurmak için sürekli düğmesini değiştirin. Dikkatlice izleyin. Floresanda ciddi bir artış olur olmaz, taramayı sonlandırın.
Ardından, orijinal görüntüleme penceresine geri dönün ve canlı modu seçin ve odağı ayarlayarak az önce hedeflenen bölgeyi bulun.
- Başarılı yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma bölgesinde küçük bir kraterin, halka benzeri yapının veya lokalize döküntülerin ortaya çıkmasıdır. Lazer gücü çok yüksek olsaydı, ölümcül olabilecek büyük bir hasarlı alan görünür olurdu.
- Şimdi kapak fişini dikkatlice çıkarın ve yaralı larvaları maya macunu ile yeni bir tabağa aktarın. Plakayı, propiyonik aside batırılmış bir doku ile birlikte 60 milimetrelik bir tabağa koyun. Ardından plakayı kültür sıcaklığına geri getirin.
Larvaların daha sonraki görüntülenmesi için, kaydedilmiş konfokal kurulumu kullanın ve 25x objektifle z yığını görüntülerini toplayın. Rejenerasyonun ölçülebilmesi için normalleştirme noktasını eklediğinizden emin olun.