JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyoloji
0 görüntüleme • 3:48 dk • April 30th, 2023
- Enjekte edilen embriyolar G0 yetişkinlerine dönüştüğünde, potansiyel F1 CRISPR düzenlenmiş hatlarını genişletmek ve genomik modifikasyonun kalıtımını izleyebilmek için tüm bireysel sinekleri uygun dengeleyici stoklara çaprazlayın. Daha sonra, bir F1 erkeği mutasyon için pozitifse, yavruları geri alabilmek için rastgele seçilen F1 bekar erkekleri uygun dengeleyici dişilerle çaprazlayın. Haç alındıktan sonra, F1 erkeğini tarama için bir tüpe aktarın.
Genomik DNA'yı çıkarmak için, sineği ekstraksiyon tamponu içeren bir pipet ucuyla ezin. Doku parçalandıktan sonra sıvıyı dışarı atın. Ekstraksiyon tamponu, numunedeki proteinleri sindiren ve yüksek ısı ile etkisiz hale getirilen bir enzim olan proteinaz K içerir.
Artık DNA'ya erişilebilir olduğuna göre, PCR taramasına geçin. Örneğin, yeni diziyi içeren bir bölgeyi yükseltmek için tasarlanmış astarlar kullanın. Sadece modifikasyonun varlığında ikinci primer bağlanacak ve bir PCR ürünü amplifiye edilecektir. Örnekte, sineklerin, dalsız genin ilk ekzonunun yerini alan bir transaktivasyon dizisinin eklenmesi için PCR ile yetiştirildiğini ve tarandığını göreceğiz.
- Daha önce hem kılavuz RNA ekspresyon plazmidi hem de replasman donörü ile enjekte edilen nos-Cas9 embriyoları yetişkinlere dönüştüğünde, çapraz G0, hedeflenen alel için uygun bir çizgiden dengeleyici sineklere ayrı ayrı uçar. Her G0 çaprazlamasından F1 yavrularını bir karbondioksit pedi üzerinde uyuşturun ve stereo mikroskop altında rastgele 10 ila 20 erkek seçin. Seçilen her erkeği hedeflenen alel için uygun bir çizgiden dengeleyici bir dişiye ayrı ayrı çaprazlayın.
F2 larvaları yumurtadan çıktığında, her çaprazlamadan F1 babasını seçin. Tamponu dağıtmadan 50 mikrolitre ezme tamponu içeren bir pipet ucuyla her sineği 10 ila 15 saniye boyunca ezerek genomik DNA'yı çıkarın. Daha sonra kalan tamponu tüpe dağıtın ve iyice karıştırın.
37 santigrat derecede 20 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, proteinaz K'yi etkisiz hale getirmek için tüpleri 1 ila 2 dakika boyunca 95 santigrat derece ısı bloğuna yerleştirin. 10.000 kez g'de 5 dakika döndürdükten sonra, daha fazla PCR analizi için preparatı 4 santigrat derecede saklayın.
Yerleştirme veya değiştirmenin varlığını taramak için ileri 1 ve geri 1 primerlerini kullanarak üç adımlı PCR tabanlı ekranlar gerçekleştirin. Üç ana bölgeden yerleştirmeyi veya değiştirmeyi doğrulamak için ileri 2 ve geri 2 primerleri kullanarak PCR gerçekleştirin. HDR sonlarını kontrol etmek için M13F ve ters 3 primerlerini kullanarak PCR gerçekleştirin.
- Onaylanmış bitiş-çıkış HDR ile uçuş çizgilerini koruyun ve F2 neslinden denge stokları oluşturun. Dengeleyici, diğer kromozomlardaki istenmeyen mutasyonları gidermek için tekrar uçar.