Yetişkin Drosophila Kafalarının Parafin İçine Gömülmesi: Histoloji için Doku Hazırlama

- Parafin gömmek için sinekleri hareketsiz hale getirmek için, anestezi uygulanmış Drosophila'yı bir sinek tasmasının boşluğundan dikkatlice itin, böylece kafaları hala vücudun geri kalanına bağlıyken cihazın üstüne düzgün bir şekilde yerleştirilir. Doku fiksasyonu için, tasmaları Carnoy'un solüsyonuna yerleştirin. Carnoy, etanol, kloroform ve asetik asitten oluşan denatüre edici bir fiksasyon maddesidir.

Numuneyi parafin infiltrasyonu için hazırlamak için, bileziği kademeli etanol konsantrasyonlarından geçirerek dokuyu kurutun. Ardından, bileziği organik bir çözücü olan metil benzoata aktarın. Daha sonra, parafinin erimiş kalmasını sağlamak için ısıtılırken bir metil benozoat ve eritilmiş parafin çözeltisine yerleştirin. Metil benzoatı çıkarmak için yalnızca önceden ısıtılmış parafin ile ayrıntılı bir dizi yıkama adımına geçin.

Ardından, bileziği hızlı bir şekilde bir kalıba yerleştirin ve tamamen kaplamak için erimiş parafin dökün. Parafin sertleştikten sonra, bloğu kalıptan çıkarın ve fazla parafini kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Parafin bloğunda gömülü kafa sırasını bırakarak bileziği kırın. Örnek protokolde, nörodejeneratif fenotiplerin analizi için gösterilen prosedürü göreceğiz.

- Başlamak için, önce, denek sineklerini boynundan yakalara geçirmek için forseps kullanın. Tüm başlıkları aynı yönde hizalayın ve kafada veya gözlerde herhangi bir hasar olmadığından emin olun. Gözsüz sinüs oculis sineklerini rastgele bilinen konumlara dahil edin, böylece sineklerin sırası bölümlerde kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, ilgilenilen sinek türünün açık veya beyaz gözleri varsa, slaytı lekelemek için yeterli pigmentin mevcut olduğundan emin olmak için kırmızı gözlü sinekleri şerit boyunca aralıklarla geçirin.

Birden fazla kullanılıyorsa, sineklerin sırasını yaka numarası ile birlikte kaydedin. Bir yaka bittiğinde, 3,5 ila 4 saat boyunca Carnoy'un solüsyonuna yerleştirin. Sinek dokusunu gömmeye hazırlamak için bir dizi etanol, metil benzoat ve parafin yıkaması yapın. Ardından, bilezikleri her bölümde bir tane olmak üzere kauçuk bir buz küpü tepsisine yerleştirin.

Hava kabarcıklarından kaçınarak erimiş parafini yakaların üzerine nazikçe dökün ve gece boyunca sertleşmesine izin verin. Bilezikleri içeren parafin bloklarını tepsiden çıkarın. Parafin bloğunu bir tıraş bıçağı kullanarak bileziğin yakasından ayırın ve bileziği nazikçe kırın. Kafalar parafin bloğunda kalırken gövdeler yakada kalacaktır.