Floresan mikroskobu için böcek bacaklarının işlenmesi: görüntüleme için nöromüsküler yapıları korumak için bir yöntem

- Başlamak için, kütikülün hidrofobikliğini azaltmak için anestezi uygulanmış böcekleri% 70 etanol çözeltisine batırın. Daha sonra, fiksasyon sırasında doku penetrasyonuna izin vermek için dokuyu en az 30 dakika boyunca bir deterjan içeren fosfat tamponlu salin ile yıkayın ve geçirgenleştirin.

Ardından, başı ve karnı torakstan çıkarın. Koksa-toraks bileşkesine hafif bir baskı uygulamak için forseps kullanın ve bacağı ayırın. Dokuya nüfuz etmesini sağlamak için bacakları gece boyunca buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit çözeltisine dikkatlice yerleştirin. Paraformaldehit, proteinleri çapraz bağlayarak dokuları sabitler.

Daha sonra, fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve dokuyu birkaç kez fosfat tamponlu tuzlu su içeren deterjanla yıkayın. Montajdan önce, tamponun dokuya girmesi için yeterli zaman sağlamak için bacakları en az bir gün boyunca saf veya hafifçe seyreltilmiş montaj tamponuna yerleştirin.

Son olarak, bacakları bir damla montaj ortamına monte edin. Numunenin hasar görmesini önlemek için mikroskop lamı ile lamel arasında bir ara parça kullanın ve montajı oje ile sabitleyin.

Aşağıdaki örnekte Drosophila melanogaster bacaklarının diseksiyonunu, fiksasyonunu ve montajını göreceğiz.

- Uygun sayıda kuyucuğu bir cam çok kuyulu plakaya% 70 etanol ile doldurarak başlayın. Her bir oyuğa herhangi bir yaş veya cinsiyetten 15 ila 20 karbondioksit anestezi uygulanmış sinek eklemek için bir fırça kullanın ve sinekleri tamamen suya batırılana kadar etanolün içine hafifçe batırın.

Bir dakikadan fazla olmamak üzere, sinekleri fosfat tamponlu tuzlu su içinde %0.3 noniyonik yüzey aktif madde deterjan çözeltisi ile yıkama başına en az 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra, torasik segmente veya bacaklara zarar vermeden her sineğin başını ve karnını çıkarmak için forseps kullanın ve bir bacağı torasik segmentten ayırmak için koksa-toraks bileşkesine nazikçe ama sıkı bir şekilde baskı uygulamak için bir çift ince forseps kullanın.

Bacakları, 4 santigrat derecede bir gece inkübasyon için buz üzerinde taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit içeren yeni bir çok kuyulu plakanın bir kuyusuna yerleştirin.

- İyi sabitlenmiş bacaklar elde etmek için bacakları yüzmelerine izin vermeden nazikçe sabitleme tamponuna itmek önemlidir.

- Ertesi gün, bacakları yıkama başına 20 dakika boyunca taze% 0.3 noniyonik yüzey aktif madde deterjan solüsyonunda beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, deterjanı montaj ortamıyla değiştirin ve bacakları en az 24 saat montaj ortamında tutun.

Ertesi gün, cam mikroskop lamının kaplanmış ucunun yanına yaklaşık 20 mikrolitre %70 gliserol ekleyin ve gliserolü 22 x 22 milimetrelik bir lamel ile örtün. Ardından, lamel hattının sağına yaklaşık 10 mikrolitrelik montaj ortamı hattı ekleyin ve 10 mikrolitrelik hattın sağına ikinci bir 30 mikrolitrelik montaj ortamı hattı uygulayın.

İnce forseps kullanarak, bir bacağı çok kuyulu plakadan bir damla orta boy halinde, dış tarafı yukarı veya aşağı yönde 10 mikrolitrelik montaj ortamı şeridine aktarın. Altı ila sekiz bacak monte edilip hizalanana kadar tekrarlayın ve ikinci lamel ilk lamel üzerinde hafifçe duracak şekilde bacakların üzerine ikinci bir lamel yerleştirin. Ardından, yerlerine sabitlemek için lamellerin her bir köşesinde oje kullanın.