$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Sinekleri küçük parçalara ayırmak için anestezi uygulanmış Drosophila'yı bir karıştırıcıda tamponla birlikte nabız atarak başlayın. Büyük gövde parçalarını çıkarmak için karışımı bir ağdan süzün. Ardından, daha büyük parçalar yüzeyde kalırken ve çıkarılabilirken yumurtaların batmasına izin verin.
Ek kalıntıları temizlemek için daha küçük bir ağ kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Yumurtaları bir şişede toplayın ve yumurtalar bir ilaçla tedavi edilecekse, bunu bu noktada yapın. Ardından, sıvıyı çıkarın ve sabitleyici ile değiştirin. Fiksatifin yumurtayı çevreleyen zara nüfuz etmesine yardımcı olmak için heptan ekleyin.
Ardından, sabitleyiciyi PBS ile yıkayın. Oositleri lekelemek için, antikor penetrasyonuna izin vermek için koruyucu dış zarları çıkarın. Oositleri bir cam slaytın buzlu kısmına pipetleyin. Yumurtaların üzerine bir layer yerleştirin ve koryon ve vitellin zarını yumurtadan mekanik olarak ayırmak için lameli ileri geri hareketlerle hafifçe yuvarlayın. Yumurtalar artık lekelenmeye hazırdır.
Örnek protokolde, iğ aparatını boyamak ve görselleştirmek için mayoz I'de oositler hazırlayacağız.
- Başlamak için, oositlerin yüzeylere yapışmasını önlemek için 5 mililitrelik bir tüpün ve Pasteur pipetinin içini PTB ile önceden kesin. Bir karıştırıcıya 100 mililitre Rob tamponu ekleyin ve ardından 100 ila 300 anestezi uygulanmış sinek ekleyin ve bir saniye boyunca üç kez vurun.
Elde edilen bulamacık, yaklaşık 1500 mikrometre gözenekli büyük bir ağdan 250 mililitrelik bir behere süzün. Süzüntünün yaklaşık iki dakika dinlenmesine izin verin ve ardından mümkün olduğunca çok sayıda büyük vücut parçasını çıkararak üst tabakayı aspire edin. Bulamacı, gözenek boyutu 300 mikrometre olan daha küçük bir ağdan 250 mililitrelik bir behere tekrar süzün.
Kalan oositleri toplamak için kaplanmış pipette ek tampon kullanarak ilk kabı durulayın. Bulamacın üç dakika dinlenmesine izin verin ve ardından alttaki 10 mililitre hariç hepsini aspire edin. Kaplanmış 5 mililitrelik tüpe mümkün olduğunca çok 10 mililitre dökün. Bulamacın yaklaşık iki dakika çökmesine izin verin ve ardından sıvıyı dikkatlice çıkarın.
10 mililitre bulamacın geri kalanını ekleyin ve sıvıyı çıkarmadan önce karışımın tekrar çökmesine izin verin. Kaplanmış pipette ek tampon kullanarak beherde kalan oositleri durulayın. Durulamanın 5 mililitrelik tüpte üç ila beş dakika oturmasına izin verin.
Yumurtalıkları sabitlemek için önce dokulardaki tüm sıvıyı aspire edin ve hemen 1 mililitre düzeltme karışımı ekleyin. Dokuları iki buçuk dakika boyunca bir nutator üzerine yerleştirin. Daha sonra, 1 mililitre heptan ekleyin, tüpü bir dakika boyunca girdaplayın ve ardından oositlerin bir dakika daha oturmasına izin verin.
Çökelmiş dokudaki tüm sıvıyı çıkarın, ardından 1 mililitre 1x PBS ekleyin. Tüpü 30 saniye boyunca girdaplayın ve ardından oositlerin bir dakika oturmasına izin verin. Bundan sonra, tüm sıvıyı tüpten çıkarın ve beş mililitre 1x PBS ile doldurun.
Kaplanmış pipeti kullanarak, buzlu bir cam slayta yaklaşık 500 ila 1.000 oosit ekleyin. Forseps kullanarak herhangi bir yabancı vücut parçasını veya materyali çıkarın. Dokunun üzerine bir lamel yerleştirin ve tüm zarlar çıkarılana kadar oositleri yavaşça yuvarlayın. Lamelin kenarını oositler boyunca sürüklemek iyi sonuç verir. Membran çıkarma işleminin ilerlemesini periyodik olarak mikroskop altında kontrol edin. Çok fazla basınç oositleri tahrip eder.