Koryon ve Vitellin Membran Mekanik Giderimi: Drosophila Oositlerini Doğrudan Gözlem İçin Hazırlama Yöntemi

- Tuzlu su çözeltisinde sabit yumurtalıklardan alınan olgun oositlerle başlayın. Olgun oositler, bir dış koryon ve iç vitellin zarından oluşan yumurta kabukları taşır.

Koryon ve vitellin zarını mekanik olarak çıkarmak için, oositleri önceden işlenmiş iki sürgünün buzlu kısımları arasına yerleştirin. Oositleri yuvarlayan sürtünme oluşturmak için üst sürgüyü düz ileri geri hareketlerle hareket ettirin.

Şimdi, oositleri başka bir yönde yuvarlamak için üst sürgüyü hafif bir açıyla hareket ettirin. Dairesel hareketlerden kaçınarak, üst sürgü alt kızağa dik olarak hareket edene kadar bu açıyı kısa artışlarla artırın. Bu hareket, koryonları ve vitellin zarlarını mekanik olarak uzaklaştırır ve oosit içine probların veya lekelerin erişmesini sağlar.

Koryonları olmayan oositler uzun ve ince görünecek ve vitellin zarı olmayanların uçları sivri olacaktır. Temizlenmiş oositleri çevredeki döküntülerden ayırmak için, numune karışımını bir tüpe aktarın ve döküntü üstte yüzerken ve çıkarılabilirken oositlerin dibe çökmesine izin verin.

Bu protokolde matür Drosophila oositlerinden koryon ve vitellin membranları çıkarılacaktır.

- Geç evre oositleri ayırmak için önce sığ bir diseksiyon kabına 1 mililitre PBSBTx ekleyin. Ardından, sabit yumurtalıkları sığ tabağa aktarmak için BSA kaplı uçlu bir P200 kullanın. Olgun oositleri daha az olgun oositlerden çıkarmak için BSA kaplı pipet ucuyla yumurtalıkları yukarı ve aşağı pipetleyin.

Geç dönem oositler yeterince ayrıldığında, tüm dokuyu 500 mikrolitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın. Tüpte yaklaşık 150 ila 200 mikrolitre bırakarak fazla sıvıyı çekilmiş bir Pasteur pipeti ile çıkarın.

Oosit yuvarlamaya hazırlanmak için, 200 mikrolitre PBSBTx ile derin bir kuyu kabını önceden ıslatın. Çanağın üzerini örtün ve bir kenara koyun.

Üç buzlu cam slayt alın ve üç slaytı bir kenara koyun. Ardından, bir ve iki slaytların buzlu cam bölgelerini hafifçe ovalayın. Cam kırıklarını çıkarmak için deiyonize suda durulayın ve tek kullanımlık bir mendille kurulayın. Bir slayta 50 mikrolitre PBSBTx ekleyerek ve bu bölgeyi diğer slaytla ovalayarak birinci ve ikinci slaytların buzlu bölgelerini PBSBTx ile kaplayın. Sıvıyı tek kullanımlık bir mendille çıkarın ve slaytları diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Birinci ve ikinci slaytların buzlu bölgelerini, ikinci slaytı destekleyen üçüncü slayt ile temas halinde tutun.

Oositleri sarmak için önce bir P200 pipet ucunu PBSBTx'te önceden ıslatın ve oositleri yukarı ve aşağı pipetleyerek mikrofuj tüpünde dağıtın. Oositleri içeren 50 mikrolitre sıvıyı, birinci slaytın buzlu cam kısmının ortasına aktarın. Bunu yapmak için ikinci sürgüyü kaldırın.

Sıvının yüzey gerilimi iki buzlu cam bölgesi arasında bir sızdırmazlık oluşturana kadar ikinci sürgüyü yavaşça indirin. Buzlu alanı kaplayacak kadar sıvı olmalı, ancak hiçbiri dışarı sızmamalıdır. Ardından, alt sürgüyü bir elinizle yerinde tutun ve diğer elinizle üst sürgüyü iki yatay yönde ileri geri hareket ettirmek için kullanın, sürgüyü iki düz tutun ve üçüncü slaytta desteklensin.

Oosit hareketlerinin ve ilerlemesinin kolay görselleştirilmesi için mikroskop altında gerçekleştirin. Yatay yönde birkaç hareketten sonra, hareket açısını hafifçe değiştirin. Çoklu artışlarla, üst sürgünün ikinci hareketi başlangıç yönüne dik olana kadar bu açıyı kademeli olarak 90 dereceye yükseltin. Sıvıda boş koryonların görüneceğini ve koryonları olmayan oositlerin daha uzun ve daha ince görüneceğini unutmayın.

- Yumurtaları yuvarlarken, yuvarlanma yönünün her zaman düz bir çizgide olduğundan ve asla dairesel bir hareket olmadığından emin olun.

- Çözelti hafif bulanıklaşana kadar yuvarlamayı yaklaşık 7 ila 10 kez tekrarlayın. Oositlerin çoğu vitellin zarlarını kaybetmiş gibi göründüğünde yuvarlanmayı bırakın.

Üst sürgüyü iki yavaşça kaldırın, köşelerinden birini alt sürgüdeki buzlu bölgenin ortasına sürükleyin, böylece haddelenmiş oositler buzlu bölgenin merkezinde birikir. PBSBTx ile her iki slayttaki oositleri PBSBTx içeren derin kuyu kabına durulayın.

Birinci ve ikinci slaytları ultra saf suyla temizleyin. Tek kullanımlık bir mendille kurulayın ve sıfırlayın. Aynı genotipteki tüm oositler yuvarlanana kadar bu adımları tekrarlayın. Bu genellikle genotip başına üç ila dört tur haddeleme gerektirir.

Haddelemeden sonra kalıntıları temizlemek için, 15 mililitrelik konik bir tüpe 1 mililitre PBSBTx ekleyin. Tüpün kenarlarını kaplamak için sıvıyı döndürün. PBSBTx kaplı bir P1000 pipet ucu kullanarak, haddelenmiş oositleri derin kuyu kabından 1 mililitre PBSBTx içeren konik tüpe aktarın. Oositleri içeren konik tüpe 2 mililitre daha PBSBTx ekleyin.

Opak oositleri batarken görmek için konik tüpü koyu bir arka plana karşı tutun. Oositlerin dibe çökmesine izin verdikten sonra, kalıntı içeren üstteki 2 mililitre çözeltiyi çıkarmak için bir P1000 kullanın ve atın.

Toplam üç tur kalıntı temizleme için adımı tekrarladıktan sonra, oositleri orijinal 500 mikrolitrelik mikrofüj tüpüne geri aktarmak için PBSBTx kaplı bir P1000 pipet ucu kullanın. 20 ila 25 dişi, yaklaşık 50 mikrolitre haddelenmiş olgun oosit vermelidir.