Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

- Başlamak için, temiz bir diseksiyon pedine bir damla tampon pipetleyin. Ardından, damlacık üzerine kurutulmuş bir canlı larva yerleştirin. Drosophila, diğer eklembacaklılar gibi, kalbin vücudun etrafına hemolenf pompaladığı ve iç organları yıkadığı açık bir dolaşım sistemine sahiptir. Eklembacaklıların birleşik kanı ve interstisyel sıvısı olan hemolenfi serbest bırakmak için forseps kullanın ve larvaların yarı sert dış kaplaması olan kütikülü açın.

Daha sonra, karkası atın ve hemolenf çözeltisini diseksiyon plakasından bir mikrosantrifüj tüpünde soğutulmuş tampon çözeltisine aktarın. Son olarak, toplanan hemolenfteki hücreler olan hemositlerin sayısını saymak için bir hemositometre kullanın. Bu protokolde Drosophila melanogaster larvalarından hemolenf toplayacağız.

- Bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre 1x PBS ekleyerek ve tüpü buz üzerine yerleştirerek hemolenf toplamaya başlayın. Ardından, temiz bir diseksiyon pedine 10 mikrolitrelik bir damla 1x PBS yerleştirin. Tek bir larva seçin ve bir mendil üzerine koyarak kurulayın. Ardından diseksiyon pedi üzerindeki PBS damlacığına aktarın.

Forseps kullanarak, hemolenfleri serbest bırakmak için kütikülü nazikçe yırtın ve ters çevirin ve ardından karkası atın. Bir pipet ile hemolenfleri diseksiyon pedinden toplayın. Hemolenfleri buzlu PBS mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. 10 mikrolitre numuneyi bir hemositometre odasına yükleyin ve bir konsantrasyon okuması yapın.