JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyoloji
0 görüntüleme • 3:56 dk • April 30th, 2023
- Yetişkin sinekte, dolaylı uçuş kasları veya IFM'ler, sineğin tüm göğüs kafesi boyunca uzanan en büyük kaslarıdır. IFM'ler, Drosophila da dahil olmak üzere iki kanatlı sineklerde karakteristik yüksek frekanslı kanat hareketlerini düzenler. İki karşıt kas lifi grubu IFM'leri oluşturur.
İlk olarak, dorsal uzunlamasına kaslar veya DLM'ler, bağırsağın üzerindeki toraksın medyan düzlemi boyunca bulunur ve önden arkaya doğru uzanır. İkincisi, dorsal ventral kaslar veya DVM'ler, toraksın üstünden altına kadar uzanır ve TDT veya atlama kası ile çevrilidir. Her iki kas grubu da kütiküle bağlıdır.
Puparium oluşumundan veya APF'den yaklaşık 48 saat sonra, olgunlaşan IFM'ler basit bir diseksiyon mikroskobu ile görsel olarak tanımlanabilir. Örnek protokolde, yüksek verimli analiz için 48 saatlik APF'den daha eski pupalardan IFM'leri toplayacağız.
- 48 saatlik APF'den sonra IFM diseksiyonu için, aşamalı pupaları bir mikroskop lamı üzerine monte edilmiş çift taraflı yapışkan bant şeridine aktarmak için hafifçe ıslatılmış bir boya fırçası kullanın. Pupaları ventral tarafı aşağı bakacak ve ön tarafı slaydın altına doğru bir çizgi halinde yönlendirin. Tüm pupalar yerleştirildiğinde, ön spiracles'in üzerindeki ilk pupa kılıfını ayırmak ve açmak için forseps kullanın ve forseps hareket ettikçe pupa kılıfını keserek bir çift forseps'i yavaşça arkaya doğru kaydırın.
Pupayı açılan kutudan serbest bırakın ve pupayı hemen ikinci bir mikroskop lamı üzerinde bir damla PBS'ye aktarın. Tüm pupalar serbest kaldığında, pupaların karnını torakstan kesmek için ince makas kullanın ve karınları ayrı bir yığın haline getirin. Tüm torakslar çıkarıldığında, PBS'nin çoğunu ve karın yığınını çıkarmak için bir parça kağıt mendil kullanın.
Göğüs kafesi ikiye bölmek için uzunlamasına gövde ekseni boyunca baştan tek bir hareketle kesmek için makası kullanmadan önce kalan göğüs kafeslerine bir damla taze soğutulmuş PBS ekleyin. Tüm pupalar diseke edildiğinde, hemiseksiyonlardan birini seçmek için beş numaralı forsepsleri kullanın ve bir forsepsin uçlarını IFM'lerin ortasının üstüne ve altına nazikçe yerleştirin.
İlk forseps çiftini sabit tutarak, IFM'nin diğer ucunun kütikül ve tendonlardan serbest bırakılmasına izin vermek için pupayı 180 derece döndürmeden önce IFM'nin bir ucunu kütikül ve tendonlardan kesmek için ince makas kullanın. Demeti yerinde tutmak için su gerilimi kullanarak IFM demetini torakstan PBS kabarcığının kenarına aktarmak için forseps kullanın.
Ardından, karkası sürgünün karşı tarafına itin ve IFM'lerin geri kalanını da aynı şekilde inceleyin. Tüm IFM'ler toplandığında, numunelere girmiş olabilecek herhangi bir atlama kası veya kütikül parçasını çıkarmak için beş numaralı forseps kullanın. Ardından, bir çift forseps arasında diseke edilmiş IFM'leri nazikçe yakalamak için su gerilimi kullanın ve IFM'leri 250 mikrolitre soğutulmuş PBS içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.