Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

- Drosophila sinir sisteminde in vivo kalsiyum görüntüleme yapmak için, GCaMP gibi genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum indikatörünün ekspresyonunu ilgili nöronlara hedefleyin. Nöronlar bir aksiyon potansiyelini ateşlediğinde, zarın hızlı depolarizasyonu voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılmasına neden olur ve bu da hücreye hücre dışı kalsiyum akışına yol açar.

GCaMP, geliştirilmiş yeşil floresan proteinin veya EGFP'nin modifiye edildiği ve N-terminalinde miyozin hafif zincirinin M13 fragmanına ve C-terminalinde kalsiyum bağlayıcı protein olan kalmodulin'e modifiye edildiği bir füzyon proteinidir. Kalsiyum kalmoduline bağlanır, GCaMP'deki konformasyon değişikliklerini tetikleyerek proteinin floresansında bir artışa neden olur.

GCaMP floresansındaki değişiklikleri in vivo nöronal aktivitenin bir temsilcisi olarak görüntülemek için, sinir sisteminin bölgesini beklenen aktivite ile ortaya çıkarın. Ardından, GCaMP dinamiklerini yakalayabilen ve bir uyaran iletim kurulumu ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın. Yanıt veren nöronlarda GCaMP floresansını kaydederken uyaranı, örneğin bir kokuyu verin.

Örnek protokolde, koku alma çağrışımsal öğrenme sırasında beynin mantar gövdelerindeki tepkileri görselleştirmek için GCaMP fonksiyonel görüntülemenin kullanıldığını göreceğiz.

- GFP tabanlı kalsiyum göstergelerinin görselleştirilmesi için, titreşim yalıtımlı bir masaya monte edilmiş, kızılötesi lazer ve suya daldırma objektifi ile donatılmış bir çoklu foton mikroskobunun lazerini 920 nanometrelik bir uyarma dalga boyuna ayarlayın ve bir GFP bant geçiren filtre takın. Kaba Z ayar düğmesini kullanarak, ilgilenilen beyin bölgesini bulmak için beynin z eksenini tarayın. Tarama süresini en aza indirmek için taramayı yalnızca ilgilenilen alana odaklamak için kırpma işlevini kullanın ve tarama görünümünü başın ön kısmı aşağı bakacak şekilde döndürün. Ardından, kare boyutunu 512 x 512 piksel olarak ayarlayın ve en az 4 Hertz'lik bir kare hızı elde etmek için her kare için hesaplanan tarama süresini dikkate alarak taranacak bölgeyi seçin.

Koku ile uyarılmış kalsiyum geçici görselleştirmesi için, görüntü alma yazılımını ve koku dağıtım programını birbirine bağlayabilen önceden programlanmış bir makro paketi başlatın ve bir F0 temel değeri oluşturmak için mikroskop yazılımında ölçümü 6,25 saniye boyunca başlatın. Koku dağıtım sisteminde, burada LED'lerin yanmasıyla gösterilen, belirli koku kabı valflerinin açılıp kapanmasıyla tetiklenen 2,5 saniyelik bir koku uyarısı ve ardından koku ofsetinin sonunda 12,5 saniyelik kayıt yapın. Ardından, ikinci ve üçüncü bir koku verici için aynı şekilde işlemi tekrarlayın.

Bu kurulumda ilişkisel koşullandırma gerçekleştirmek için, 12 adet 90 voltluk elektrik şokunun yanı sıra koşullandırılmış uyaranı ve kokuyu 60 saniye boyunca sunmak için bilgisayar kontrollü koku dağıtım sistemini kullanın. 60 saniyelik bir aradan sonra, elektrik çarpması olmadan 60 saniye boyunca durum uyarısı eksi kokuyu tek başına sunun. Egzersiz aşamasını bitirdikten 3 dakika sonra egzersiz öncesi koku stimülasyon protokolünü tekrarlayarak egzersiz sonrası koku ile uyarılan kalsiyum geçişlerini tekrar ölçün. Ardından, görüntüleme dosyalarını daha sonra görüntü analizi için uygun bir biçimde kaydedin.