JoVE Encyclopedia of Experiments
Biyoloji
0 görüntüleme • 2:56 dk • April 30th, 2023
- Yıkanmış C. elegans'ı sıvı içinde, solucan tırnak etlerinin cam yüzeye yapışmasına yardımcı olacak bir bileşik olan poli-lizin ile kaplanmış bir cam slayt üzerine aktarın. Bir kenarı alt sürgüden sarkan başka bir cam sürgüyü düz bir şekilde aşağı doğru hafifçe bastırın. Solucanları zarar vermeden hareketsiz hale getirmek için, herhangi bir yanal hareketten kaçınarak hayvanları sıkıştırın. Ardından, sıvı nitrojen veya kuru buz gibi bir dondurma maddesi ile doldurulmuş yalıtılmış bir laboratuvar kabının içindeki metal bir blok üzerine sıkıştırılmış solucanlı cam slaytları yerleştirin.
Metal, blok yüzeyinin, solucanın tırnak etlerini her iki cam yüzeye hızlı bir şekilde dondurmak için yeterince soğuk olmasını sağlayan etkili bir sıcaklık iletkenidir. Dondurulduktan sonra, solucan tırnak etlerini ayırmak veya açmak için cam kızakları hızla ayırın. Düşük geçirgenliğe sahip kütikülün bozulması kimyasal fiksatiflerin ve boyama antikorlarının iç solucan dokularına erişmesine izin verdiğinden, doku fiksasyonu ve boyamaya devam edin. Aşağıdaki protokolde, dondurarak parçalama tekniğinin ve doku fiksasyonunun ayrıntılı bir gösterimini göreceğiz.
- İlk olarak, solucanları düzeltmek için bir slayt hazırlayın. Bir slayt üzerine 30 mikrolitre poli-L-lizin pipetleyin ve ardından diğerinin üzerine ikinci bir slayt yerleştirin ve çözeltiyi her ikisine de eşit şekilde yaymak için birbirine sürtün. Şimdi, iki slaytı ayırın ve 30 dakika kurumaya bırakın.
Ardından, sıvı nitrojenle dolu bir kabın içine düz bir metal blok yerleştirin. Plakaları M9 solüsyonu ile yıkayın ve solucanları içeren yaklaşık 10 mikrolitre M9 aktarın. Alternatif olarak, solucanları toplayın ve slayta M9 ekleyin.
Solucanlar aktarıldıktan sonra, lamel bir kenardan sarkacak şekilde üzerlerine çapraz olarak bir lamel bırakın. Ardından, herhangi bir yanal hareket yapmadan lamel üzerine hafifçe bastırın.
Şimdi, sürgüyü hemen sıvı nitrojen içindeki metal bloğa aktarın ve donmasına izin verin. Beş dakika sonra, sarkan kenarı kullanarak lamel hafifçe vurun. Kütikülün uygun çatlağını elde etmek için bunu hızlı bir şekilde yapın.
Ardından, slaytı eksi 20 santigrat derecede metanol dolu bir cam Coplin kavanozuna daldırın. Beş dakika sonra, slaytı aynı sıcaklıkta beş dakika daha aseton dolgulu bir cam Coplin kavanozuna aktarın. Slaytlar doğrudan boyanabilir veya eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.