C. elegans Gonad Ekstrüzyonu: Hızlı Bir Diseksiyon Tekniği

- M9 tamponu içeren bir tüpte, istenen gelişim aşamasında 150'ye kadar hermafrodit solucanı toplayın. M9 tamponu ile yıkayarak ve numuneyi santrifüjleyerek solucanlardan bakterileri çıkarın.

Numune kaybını önlemek için süpernatanı çıkarırken tüpü diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. Solucanları minimum hacimde M9 tamponu olan bir cam kaba aktarın. Solucanları uyuşturmak için levamisol ekleyin.

Solucanın başını ve iki ampul şeklinde yapı içeren farenksi veya ön bağırsağı bulun. Farenksin arkasındaki solucanı kesmek için iki iğne kullandı. Dokuyu etkilememek için diseksiyonu hızlı bir şekilde tamamladığınızdan emin olun.

Kütikül bozulduğunda, solucanın iç basıncı nedeniyle iki gonad kolu ekstrüde edilir veya vücuttan dışarı itilir.

Bu örnekte, immünofloresan analizi için yetişkin solucanlardan gonadları inceleyeceğiz.

- İstenilen gelişim aşamasında 100 ila 150 solucan seçin ve bunları 100 mikrolitre M9 tamponu içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Daha sonra, mikrosantrifüj tüpünü 900 mikrolitre daha fazla M9 tamponu ile doldurun ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 1.000 kez g'de santrifüjleyin.

Diseksiyon mikroskobu altında, M9 tamponunun 900 mikrolitresini yavaşça çıkarın. Ardından, bağlı bakterilerin çoğunu çıkarmak için yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.

Ardından, genişletilmiş bir deliğe sahip 200 mikrolitrelik bir mikropipet ucu kullanarak, solucanları 100 mikrolitre M9 tampon içinde düz tabanlı bir cam saat kabına aktarın. Ardından, tabağa 1 ila 3 mikrolitre 0.1 molar levamisol ekleyin ve hafifçe döndürün. Şimdi, her el için bir diseksiyon aleti yapmak için iki şırıngaya iki adet 25 gauge iğne takın.

Diseksiyon mikroskobu altında, her bir iğneyi her bir solucanın altına ve üzerine yerleştirin ve makas benzeri bir hareket kullanarak ikinci faringeal ampulün yakınındaki her solucan üzerinde ince bir kesim yapın. Levamizolün etkili kalması için tüm hayvanları en az beş dakika içinde en az bir kez kesin.

- Tabaktaki hayvanların diseksiyonunun beş dakikadan kısa sürede tamamlanması çok önemlidir.

- Ekstrüde edilmiş bir gonad görünmüyorsa, o hayvanın üzerinden atlayın. Uygun ekstrüde gonadlar burada görülebilir.