Tek Solucan PCR: Genomik DNA'yı Çıkarmak ve Çoğaltmak için Bir Yöntem

- Tek kurt PCR analizi için, bir hermafrodit solucanının kendi kendini döllemesine ve genetik olarak aynı yavrular üretecek yumurtaları bırakmasına izin verin ve bu nedenle değiştirilmiş suşun bir kopyasını koruyun. Daha sonra, ebeveyni solucan lizis tamponu içeren bir tüpe aktarın.

Kütikülü veya dış tabakayı kırmak için tüpü eksi 80 santigrat derecede dondurun. Solucan hücrelerini parçalamak için numuneyi artı 60 santigrat dereceye ısıtın ve hücrenin genomik DNA'sı ile birlikte hücre içi proteinleri serbest bırakın. Bu sıcaklıkta, tampon içindeki proteinaz K, proteinleri, özellikle de genomik DNA'yı yok edecek olan nükleazları bozar.

Ardından, enzimi etkisiz hale getirmek için sıcaklığı 95 santigrat dereceye yükseltin. Son olarak, hücre lizatını, reaksiyon tamponu, dNTP'ler, ilgilenilen bölge için ileri ve geri primerler, taq polimeraz ve reaksiyonu istenen bir nihai hacme getiren sudan oluşan bir PCR ana karışımı ile bir tüpe ekleyin. PCR'yi gerçekleştirmek için, ilgilenilen DNA bölgesini amplifiye eden uygun termal döngüleyici programını çalıştırın.

Aşağıdaki örnekte, tek F1 solucanlarının genomik DNA'sındaki CRISPR-Cas9 düzenleme olaylarını taramak için bir PCR prosedürü göreceğiz.

- 1 ila 2 günlük yumurtlamadan sonra, F1'leri 7 mikrolitre ılık lizis tamponu içeren ayrı PCR şerit tüp kapaklarına aktarmak için bir solucan resmi kullanın. Hayvanları tüpün dibine getirmek için PCR tüplerini maksimum hızda ve oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyin. Ardından, tüpleri bir saat boyunca eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Daha sonra, aşağıdaki programı kullanarak donmuş solucanları bir termal döngüleyicide parçalayın. Ardından, bu tabloda gösterildiği gibi bir PCR ana karışımı ayarlayın.

Temiz PCR tüplerine 21 mikrolitre PCR ana karışımı ekleyin. Daha sonra 4 mikrolitre solucan lizis tüpü ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.

Ardından, üreticinin yönergelerini izleyerek PCR programını çalıştırın.