Caenorhabditis elegans'ın Tek Hücre Ayrışması: Canlı Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

- Yıkanmış peletlenmiş solucanlarla başlayın ve SDS, bir deterjan ve bir indirgeyici ajan olan DTT içeren lizis tamponu ekleyin. Bu, solucanın koruyucu kütikülünü parçalayarak vücudu hücre ayrışmasına maruz bırakır. Hücre lizizini ve ölümünü en aza indirmek için lizis tamponuna uzun süre maruz kalmaktan kaçının.

Daha sonra, lizis reaktiflerini birkaç yıkama soğuk izolasyon tamponu ile çıkarın. Hücre ölümünü önlemek için bu tamponun doğru ozmolariteye sahip olması önemlidir. Hücreden hücreye bağlantıları parçalamak için bir proteaz enzimi kullanın. Karışımı tüp duvarına pipetleyerek mekanik enerji ile birlikte homojenizasyon işlemine yardımcı olun.

Enzim reaksiyonunu durdurmak için serum ve kontaminasyonu önlemek için antibiyotik içeren ortam ekleyin. Kalıntıların çoğunu temizlemek için numuneyi birkaç kez pelet haline getirin ve yıkayın.

Son olarak, yerçekimi sedimantasyonuna izin vermek için tüpü buzun üzerine yerleştirin. Kütikül kalıntıları veya hücre kümeleri de dahil olmak üzere döküntüler çökelirken, ayrışmış hücreler ortamın üst tabakasında asılı kalır. Bu hücreler, kısa süreli kültürleme için veya FACS veya immünopresipitasyon ile spesifik hücre popülasyonlarını izole etmek için kullanılabilir.

Örnek protokolde, bu hücreleri izole etmek ve analiz etmek için ilgilenilen nöronlarda GFP eksprese eden transgenik solucanları ayrıştıracağız.

- Hayvanları topladıktan sonra, beş dakika boyunca 1.600 kez g'da santrifüjleyin. Tüm süpernatanı çıkarın ve solucanları 1 mililitre M9 ortamında yeniden askıya alın. Süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Solucanları peletlemek için beş dakika boyunca 1.600 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, 200 mikrolitre SDS-DDT tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Solucanlar şimdi ışık mikroskobu altında bakıldığında vücut boyunca buruşuk görünmelidir.

Ardından, 800 mikrolitre buz gibi soğuk izolasyon tamponu ekleyin ve tüpü hafifçe vurarak karıştırın. Solucanları peletlemek için 13.000 kez g ve 4 santigrat derecede bir dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 mililitre izolasyon tamponu ile yıkayın.

Bu santrifüjleme ve yıkama işlemini toplam beş kez tekrarlayın ve her seferinde izolasyon tamponunu dikkatlice çıkardığınızdan emin olun. Bundan sonra, izolasyon tamponunda çözülmüş Streptomyces griseus'tan 100 mikrolitre proteaz karışımını pelete ekleyin.

Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika inkübe edin. 200 mikrolitrelik mikropipet ucu tüpün dibine değecek şekilde 60 ila 70 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak mekanik bozulma uyguladığınızdan emin olun. Sindirim aşamasını belirlemek için, sindirim karışımından 1 ila 5 mikrolitre çıkarın, bir cam lam üzerine bırakın ve bir doku kültürü mikroskobu kullanarak inceleyin.

Beş ila yedi dakika sonra, solucan parçaları gözle görülür şekilde azaltılmış bir kütiküle sahip olmalıdır ve bir hücre bulamacı kolayca görülebilir olacaktır. % 10 FBS ve penisilin-streptomisin ile desteklenmiş, ticari olarak temin edilebilen Leibovitz'in L15 besiyerinden 900 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun.

İzole edilmiş parçaları ve hücreleri peletlemek için 10.000 kez g ve 4 santigrat derecede 5 dakika santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri, yıkama başına 1 mililitre ortam kullanarak soğuk L15 takviyeli ortamla iki kez daha yıkayın. Peletlenmiş hücreleri 1 mililitre L15 takviyeli ortamda tekrar süspanse edin ve 30 dakika buz üzerinde bırakın.

Daha sonra yaklaşık 700 ila 800 mikrolitre olan üst tabakayı alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 10 ila 25 mikrolitre izole edilmiş hücrenin hücre yoğunluğunu ölçmek için otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın.