C. elegans Beslemesi için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA Ekspresyonunu İndüklemek İçin Bir Teknik

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyoloji

0 görüntüleme • 3:24 dk • April 30th, 2023

- C. elegans'ta RNAi, rekombinant bir DNA plazmidinden çift sarmallı RNA veya dsRNA eksprese eden solucan bakterileri besleyerek indüklenebilir.

Başlamak için, tetrasiklin ve ampisilin veya fonksiyonel analog karbenisilin içeren seçici LB agar plakaları üzerinde gece boyunca L4440 plazmid ile transfekte edilmiş tetrasikline dirençli HT115 E. coli'yi büyütün. Hedef DNA'ya ek olarak, plazmit ampisilin direnci için bir gen içerir. Sadece plazmidi miras alan bakteri kolonileri bu antibiyotiklerin varlığında büyüyebilir.

Daha sonra, bakteri kolonilerini hasat edin ve bunları sıvı LB ortamında istenen konsantrasyona genişletin. DsRNA ekspresyonunu indüklemek için, bakteri çözeltisini hazırlanmış nematod büyüme ortamına veya NGM, IPTG içeren agar plakalarına aktarın.

Bu ekspresyon sisteminde, IPTG, T7 RNA polimerazın ekspresyonunu sağlayan lak baskılayıcıyı inaktive etmek için laktozu taklit eder. Plazmid üzerinde, hedef DNA ekspresyonu iki yakınsak T7 promotörü tarafından düzenlenir. Sonuç olarak, anlam ve anti-anlam dizileri kopyalanır ve bu da dsRNA'nın ekspresyonuna yol açar.

Son olarak, solucan, tamamlayıcı dizilerle endojen mRNA'ları aşağı regüle etmek için yutulan dsRNA'dan gelen dizi bilgisini kullanır. Bu deneyde, C. elegans beslemesi için transgenik E. coli içeren RNAi plakaları hazırlayacağız.

- RNAi plakaları için, IPTG ve karbenisilin içeren NGM agar ile 6 santimetrelik plakalar yükleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 24 ila 48 saat kurumaya bırakın. Ardından, 14 güne kadar 4 santigrat dereceye aktarın.

Daha sonra, lin-53 genini taşıyan L4440 plazmidli RNAi bakteri klonları ile karbenisilin ve tetrasiklin içeren seçici plakaları çizgileyin. Üç fazlı bir çizgi deseni kullanın ve boş bir vektör kontrolü plakaladığınızdan emin olun. Ardından, plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün.

Ertesi gün, en az üç tek koloni seçin ve her birini karbenisilin ile desteklenmiş, ancak tetrasiklin içermeyen 2 mililitre LB içeren ayrı bir kültür tüpüne aşılayın. Koşul başına üç sağlıklı kültüre sahip olmayı planlayın.

Daha sonra, kültürleri 600 nanometrede 0,6 ila 0,8 arasında bir optik yoğunluğa ulaşana kadar gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Ardından, 6 santimetrelik bir NGM agar RNAi plakasına her bakteri kültüründen 500 mikrolitre ekleyin. Plakaları gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.

09:40

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:50

Bulaştırmak için bir protokol

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:53

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:20

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1 olarak Adaylar

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:22

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:15

Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:59

Hücre Kaderi Nematod Germ Hücrelerinin Nöronlara Yeniden Programlanması

İlgili videolar

0 Görüntüler

18:38

Büyük ölçekli Gen demonte olarak

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:52

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:55

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026