JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 3:24 dk. • April 30th, 2023
- C. elegans'ta RNAi, rekombinant bir DNA plazmidinden çift sarmallı RNA veya dsRNA eksprese eden solucan bakterileri besleyerek indüklenebilir.
Başlamak için, tetrasiklin ve ampisilin veya fonksiyonel analog karbenisilin içeren seçici LB agar plakaları üzerinde gece boyunca L4440 plazmid ile transfekte edilmiş tetrasikline dirençli HT115 E. coli'yi büyütün. Hedef DNA'ya ek olarak, plazmit ampisilin direnci için bir gen içerir. Sadece plazmidi miras alan bakteri kolonileri bu antibiyotiklerin varlığında büyüyebilir.
Daha sonra, bakteri kolonilerini hasat edin ve bunları sıvı LB ortamında istenen konsantrasyona genişletin. DsRNA ekspresyonunu indüklemek için, bakteri çözeltisini hazırlanmış nematod büyüme ortamına veya NGM, IPTG içeren agar plakalarına aktarın.
Bu ekspresyon sisteminde, IPTG, T7 RNA polimerazın ekspresyonunu sağlayan lak baskılayıcıyı inaktive etmek için laktozu taklit eder. Plazmid üzerinde, hedef DNA ekspresyonu iki yakınsak T7 promotörü tarafından düzenlenir. Sonuç olarak, anlam ve anti-anlam dizileri kopyalanır ve bu da dsRNA'nın ekspresyonuna yol açar.
Son olarak, solucan, tamamlayıcı dizilerle endojen mRNA'ları aşağı regüle etmek için yutulan dsRNA'dan gelen d
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin