Dört Olfaktometre Testi: Drosophila'da Koku İşaretli Tepkileri Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

- Dört bir olfaktometre, her köşesinde tek yönlü bağlantı noktalarına sahip kapalı bir odadır ve bu sayede dört adede kadar koku iletebilir ve farklı koku profillerine sahip kadranlar oluşturabilir. Uyanık sinekleri odaya aktararak bir deneye başlayın. Anesteziden kaçının, çünkü bu deney sırasındaki davranışlarını etkileyebilir.

Sinekleri temiz havaya maruz bırakın ve koku maddelerinin olfaktometreyi kirletmediğinden ve sinek davranışını etkilemediğinden emin olmak için hareketlerini gözlemleyin. Ardından, test koku maddelerini ayrı şişelerde hazırlayın ve bunları tek yönlü portlar aracılığıyla ana hazneye bağlayın. Sinekleri önceden tanımlanmış bir süre boyunca koku vericilere maruz bırakın ve deneme sona erdikten sonra uyaranı çıkarın.

Sinekler, çekici kokulara sahip kadranlara doğru hareket ederken ve yerleşirken, itici kokulara sahip kadranlardan kaçınma eğilimindedir. Olfaktometreyi keşfederken zaman içindeki konumlarını takip ederek sineklerin koku işaretli davranışsal tepkilerini ölçün.

Aşağıdaki protokolde, itici bir koku verici olan etil propiyonat ve çekici olan elma sirkesine yanıt olarak sinek davranışını analiz etmek için hava dağıtım sistemine sahip dört kadranlı bir olfaktometre kullanacağız.

- En az beş dakika önceden sıcaklık kontrol cihazını açın ve 25 santigrat dereceye ayarlayın. Ardından, koku verici odalarını plastik bir tüp aracılığıyla arenaya bağlayın. Elektronik bir akış ölçer kullanarak arenanın her çeyreğindeki hava akış hızını kontrol edin. Kontrol, koku ve hava akımlarının her ikisinin de dakikada 100 mililitre hızında çalıştığından emin olun.

- Sinekler hava akışına karşı çok hassastır ve her kadran için hava akışının her deneyden önce doğrulanması çok önemlidir.

- Şimdi, arenayı ve cam plakaları %70 etanol kullanarak temizleyin. Devam etmeden önce tüm parçaları iki ila üç kez silin ve tamamen kurumaya bırakın. Ardından, cam plakaları arenaya kelepçeleyin. Ardından, sinekleri anestezi olmadan arenaya aktarın. Yerçekimini kullanarak, cam plakalardan birindeki delikten girmelerine izin verin ve ardından deliği dairesel bir ağ ile kapatın.

Şimdi, sinek yüklü arenayı ışık geçirmez odaya yerleştirin. Ardından, dört kontrol hava akımını her bir arena köşesine bağlayın. Odanın kapısını kapatın ve sineklerin 10 ila 15 dakika boyunca yeni ortama alışmasına izin verin.

Alışma periyodundan sonra, sineklerin dört kontrol hava akımına maruz kaldığı 5 ila 10 dakikalık bir kontrol deneyi yapın. Artık verileri hemen analiz etmek çok önemlidir. Sinekler arenada eşit olarak dağılmamışsa, arena sıfırlanmalıdır.

- Kontrol sineklerinin davranışını sadece temiz hava için test etmek çok önemlidir. Bu, tüm arka plan koşullarının normal olduğunu hızlı bir şekilde doğrulayacaktır. Sızan ışık, sıcaklık dengesizliği, eğimli arena veya koku kirliliği sorunlara neden olabilir.

- Gerekirse, sinekleri atın ve arenayı tekrar temizleyin. Koku verici bir kontaminasyondan şüpheleniliyorsa, tüm boruları değiştirin. Hayvanlar dört kadrandan herhangi birini tercih etmeyene kadar kontrol testini yeni kohortlarla tekrarlamaya devam edin. Ardından, üç bir vana kullanarak test koku haznesini kuruluma bağlayın veya boruyu yeniden bağlayın ve 5 ila 10 dakika boyunca bir test deneyi yapın. Daha uzun deneysel kayıtlar için, izleme programını her 20 dakikada bir hızlı bir şekilde durdurun ve yeniden başlatın, aksi takdirde veri dosyaları çok büyük olacaktır.

Testler arasında sinekleri atın, arenayı ve cam plakaları %70 etanol ile temizleyin ve bağlantı tüplerini değiştirin. Sistemi sürekli olarak yıkamak için kuru hava akışını devam ettirin. Verimlilik için, koşular sırasında temizlik yapılabilmesi için iki arenaya sahip olmak iyidir.

- Aynı gün içinde birkaç deney yapılırsa, sistemde önceki bir çalıştırmadan kalma koku kalmadığından emin olmak için çok dikkatli olun. Bu normalde düşük konsantrasyonlarda koku verici veya CO2 ile ilgili bir sorun değildir. Ancak yüksek konsantrasyonlu uyaranlar için, deney çalıştırmaları arasında 24 saate kadar bir boşluk gerekebilir.