Canlı Drosophila Embriyolarının Mikroenjeksiyonu: Reaktiflerin Gelişmekte Olan Embriyoya Erken Verilmesi

- Canlı Drosophila embriyolarını toplayın ve şeffaf olmayan koryonlarını çıkarın. Ardından, bir cam lamel üzerine, sıvı heptan içinde çözülmüş bant yapıştırıcısı olan bir dizi heptan yapıştırıcısı uygulayın. Artık dekoryona uğramış embriyoları işleyebilmek için, numuneleri yapıştırıcı üzerine arka arkaya dikkatlice hizalayın.

Embriyoları kısmen kurutmak için lamel bir dehidrasyon odasına aktarın. Bu, enjeksiyonlar sırasında veya sonrasında sitoplazmik sızıntıyı önleyecektir. Daha sonra, lameli çıkarın ve oksijenin embriyolara yayılmasına izin verirken daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoları halokarbon yağı ile kaplayın.

Mikroenjeksiyonu gerçekleştirmek için uyumlu bir mikroskop üzerinde bir mikroenjeksiyon sistemi kullanın. Göz parçalarına bakarak, hem embriyoları hem de enjeksiyon çözeltisi ile önceden yüklenmiş iğneyi tanımlayın. İğneyi kırın ve tutarlı ve uygun boyutta sıvı damlaları ürettiğinden emin olun. Daha sonra iğneyi embriyonun içine getirin ve uygun hacmi enjekte edin. İğneyi çıkarın ve kalan embriyolar için enjeksiyonu tekrarlayarak bir sonrakine geçin.

Örnek protokolde, hücre bölünmesinin canlı görüntüleme çalışmaları için Drosophila embriyo mikroenjeksiyonunun bir gösterimini göreceğiz.

- Lameli kurmadan önce, çift yapışkanlı bandı açarak ve 100 mililitrelik bir şişeye koyarak heptan yapıştırıcısı yapın. Yaklaşık 50 mililitre heptan ekleyin, şişeyi kapatın ve birkaç gün sallayın.

Embriyoları hazırlamadan önce, enjeksiyondan önce embriyoların yerleştirileceği bir dehidrasyon odası yapın. Bunu yapmak için, bir "masa" yapmak için 35 milimetrelik bir kabın bir parçasını 100 milimetrelik bir Petri kabının içine koyun. Etrafına susuz kalsiyum sülfat olan Drierit'i ekleyin, böylece Kurutucu'nun yüksekliği "masadan" daha yüksek olmayacak şekilde ve örtün.

Embriyoları hazırlamaya başlamak için, önce üzüm suyu tabağını her saat başı maya ile değiştirerek onları kafesten toplayın. Embriyolar, koleksiyonun başlamasından yaklaşık iki saat sonra görüntülenmelidir. Lameli hazırlamak için, bir mikroskop lamının bir tarafına yerleştirin ve hareket etmemesi için dört köşesini bantlayın.

Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak, lamel üzerine bir çizgi halinde bir kat heptan yapıştırıcı koyun. Tutkal viskoz olmamalı ve birkaç saniye içinde kurumalıdır. Çok kalınsa, daha fazla heptan ekleyin.

Son olarak, lamel yanındaki slayda bir parça çift yapışkan bant koyun. Nemli bir fırça ile embriyoları üzüm suyu tabağından dikkatlice alın ve slayttaki çift yapışkan bandın üzerine yerleştirin.

Daha sonra, koryon açılana kadar embriyoları çift yapışkan bant üzerinde yuvarlamak için bir cımbızın yarısını kullanın. Embriyoyu koryonun üzerinde nazikçe yuvarlayarak alın, böylece cımbıza yapışır ve embriyonun uzun tarafı lamel uzun kenarına paralel olacak şekilde lamel üzerindeki heptan yapıştırıcının üzerine yerleştirin.

Bir sıraya 10 ila 20 embriyo yerleştirin. Lameli çıkarın ve üç ila sekiz dakika boyunca dehidrasyon odasına koyun. Süre, yerel neme ve enjekte edilecek miktara bağlıdır. Ardından, lameli vakumlu gres ile metal bir hazneye yerleştirin. Son olarak, daha fazla dehidrasyonu önlemek için embriyoları halokarbon yağı ile kaplayın. Embriyolar artık enjeksiyon için hazırdır.

İlk olarak, 16X hedefinin altındaki embriyoları bulun. Embriyoları uzaklaştırın ve odak düzlemini hareket ettirmeden iğneyi bulun. İğneyi ortalayın ve X veya Y yönünde hareket ettirmeden yukarı doğru hareket ettirin.

İğneyi açmak için, lamel kenarını görüş alanına koyun, ancak bir iğnenin olacağı yere koymayın ve iğneyi aynı odak düzlemine indirin. Çok dikkatli bir şekilde, lameli iğneye çarpana ve yavaşça kırana kadar hareket ettirin. İğneyi yukarı doğru hareket ettirin.

Şimdi embriyoları görünür hale getirin. İğneyi yağın içine indirin ve iğneden güzel sıvı damlaları aldığınızdan emin olun. Embriyoyu sabit bir şekilde iğnenin içine taşıyın, embriyoya bir damla enjekte edin ve ardından embriyoyu uzaklaştırın. Tüm embriyolar enjekte edildikten sonra, 60 veya 100X objektifli bir konfokal mikroskopta gözlem için hazır hale gelirler.