$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Halka bezini incelemek için, bir diseksiyon mikroskobuna, iki forseps, diseksiyon bıçağı görevi görecek ince bir iğneye ve tamponlu bir çözeltiye ihtiyacınız olacaktır. Ağız kancalarını içeren larvaların başını tanımlayarak halka bezini bulun. Göğüs kafesi ve karın bölümleri arasında bulunan beyni bulmak için larvaların uzunluğu boyunca seyahat edin. Halka bezi beyinden daha küçüktür ve üstte bulunur.
Larva halka bezi, üç farklı endokrin organ içeren karmaşık bir endokrin yapıdır. Korpus allatum, halka bezinin merkezinde bulunur ve gelişimi ve yaşlanmayı düzenleyen juvenil hormon üretir. Protorasik bez, korpus allatumu çevreler ve yapının çoğunu oluşturur. Böcek maltlamasında rol oynayan bir hormon olan ekdison bu bez tarafından yapılır. Protorasik bezin altında, bir besin düzenleyici olan adipokinetik hormon üreten korpus kardiyakum bulunur.
Bu örnekte, immünohistokimya için larva beyinlerini ve halka bezlerini inceleyeceğiz.
- Larvaları hazırladıktan sonra, diseksiyon mikroskobu altında PBS ile doldurulmuş üç santimetrelik bir tabakta kurs diseksiyonuna başlayın. İlk olarak, ağız kancasını forseps ile kavrayın. Daha sonra, mikro makas kullanarak, vücudu ön uçtan uzunluğun yaklaşık üçte biri oranında kesin. Daha sonra, ön uzunluğu bir çift forseps ile tutun ve sonuçta larva gövdesini ters çevirmek için başın ucunu vücuda hafifçe itmek için ikinci bir çift kullanın.
10 dakika içinde bu şekilde 20'ye kadar larva hazırlayın ve daha sonra bunları fiksatif çözeltiye aktarın. 30 dakika sonra, preparatları yıkayın ve immüno-boyama ile devam edin. Larvaları immün boyadıktan sonra, numuneleri %0.3 PBT ile doldurulmuş bir tabağa aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın.
Diseksiyon mikroskobu altında, kütikülü veya ağız kancasını bir çift forseps ile kavrayın. Ardından, yemek borusunun ve göz disklerinin ön ucunu keserek beyin halkası bezi-göz diski kompleksini vücut kütikülünden çıkarmak için bir mililitrelik şırıngaya bıçak gibi bağlı 27 gauge bir iğne kullanın.
Daha sonra, forseps kullanarak, yemek borusunu ve bağırsağı beyin-halka bezi-göz diski kompleksinden dikkatlice ayırın. Yemek borusu beyinden ventral sinir kordonunun üzerinden geçtiği için bağırsağı arka tarafa doğru çekin. Son olarak, beyin halkası bezi kompleksini izole etmek için beyin diski, göz diskleri ve bacak diskleri arasındaki bağlantıları bir iğne bıçağıyla dikkatlice kesin.
- Diseksiyon sırasında keskin kenarlı ince forseps kullanmak oldukça önemlidir. Ayrıca, kenarlarını boşluk bırakmadan bir araya getirmek için forsepsleri bir Arkansas taşlama taşıyla keskinleştirmenizi şiddetle tavsiye ederim.
- Numuneleri aktarmak için geniş delikli uçlu bir mikropipet kullanın. Numuneleri cam sürgünün ortasına yerleştirin. Daha sonra, numuneleri ventral taraflarına yerleştirmek için forseps kullanın, böylece beynin sırt tarafında bulunan halka bezi görüntülenebilir. Ardından, slaytı eğin ve fazla PBT'yi mümkün olduğunca silin. Ardından, numunelerin yanına bir damla montaj reaktifi koyun ve reaktifin üzerine ve ardından numunelerin üzerine bir lamel yavaşça indirmek için forseps kullanın.