Drosophila kalbinin hazırlanması: yetişkin sineklerde kalp fizyolojisini incelemek için bir teknik

- Omurgalılardan farklı olarak, Drosophila kalbi açık bir dolaşım sisteminin parçasıdır. Yetişkin bir sineğin kalbi, epidermise alary kasları ile bağlanan ve hücre dışı matrise gömülü kardiyomiyositlerden yapılmış tüp benzeri bir yapıdır. Kalp odası sineğin arka ucundadır ve hemolenfleri açık vücut boşluğuna aktığı aort içine pompalar.

Böceklerde hemolenf hem kan hem de interstisyel sıvı görevi görür, besinleri, sinyal moleküllerini ve bağışıklık hücrelerini taşır. Kalbin ek işaretleri arasında, tüp boyunca açıklıklar olan ostia ve intrakardiyak kapakçıklar bulunur. Perikardiyal hücreler kalp tüpü boyunca lokalizedir ve sineğin boşaltım sisteminin bir parçasıdır.

Deneysel bir kalp preparatında, yapay hemolenf, doku fonksiyonunu korumak için fizyolojik koşulları taklit eder. Doğal hemolenf gaz değişiminden sorumlu olmasa da, fonksiyonel bir trakeal sistem eksikliğinin yerini almak için yapay hemolenf iyi oksijenlendirilmelidir. Aşağıdaki deneyde, canlı görüntüleme veya elektrofizyoloji için yetişkin bir sinekten yarı sağlam bir kalp hazırlığı gösteriyoruz.

- Başlamadan önce yapay bir hemolenf solüsyonu hazırlıyoruz. Bu çözelti, bakteriyel kontaminasyonu önlemek için kullanımdan hemen önce soğutulmuş stok çözeltilerinden yapay hemolenfeğe eklenmesi gereken sükroz ve trehaloz içerir. Yapay hemolenfleri oda sıcaklığına getirin ve çözeltiyi en az 15 dakika hava köpürterek oksijenlendirin.

Daha sonra, sinek içindeki yağ kütlelerinin çıkarılması için gerekli olacak standart bir pipet çektirmesi kullanarak birkaç ince kılcal damar çekin.

Her şey hazırlandıktan sonra, yetişkin sinekler uyuşturulmalıdır. Bu, iki ila beş dakika boyunca sinek uykusuna kısa bir süre maruz kalarak yapılabilir, ancak sinekleri sinek uykusunda beş dakikadan daha uzun süre bırakmamaya dikkat edin. Soğuğa kısa süreli maruz kalma, sinekleri uyuşturmak için de kullanılabilir, ancak kalp atış hızı ve ritmikliği üzerinde daha uzun süreli etkileri olduğu için karbondioksit önerilmez.

Daha sonra, uyuşturulmuş sinekler, sırt tarafı aşağı bakacak şekilde, ince bir vazelin tabakası ile kaplanmış bir Petri kabına yerleştirilir. Kanatlardaki ve vücuttaki hidrofobik kütikül, jöleye geri dönüşümlü olarak yapışmalıdır, ancak gerekirse sinek yeniden konumlandırılabilir. İlk kesim, kavisli bir çift yaylı makas kullanılarak yapılır. Bu, makas bıçaklarının sineğin bacaklarının altına yerleştirilmesiyle ve boynun yakınındaki göğüs kafesinin dorsal yüzeyine doğru açılı olarak yerleştirilmesiyle yapılır.

Baş, ventral sinir kordonu ve bacaklar tek bir kesi ile çıkarılır. Kesildikten sonra, preparat daha sonra oksijenli yapay hemolenf çözeltisine daldırılır. Yaylı makas kullanılarak karın segmenti 7 ve 8'den oluşan karın arka ucu tek bir kesi ile çıkarılır. Bu, karnın her iki kenarı boyunca yanal kesimler yapmak için erişim sağlar ve arka bağırsak ile abdominal kütikül arasındaki bağlantıyı kesmeye hizmet eder.

Makasın bıçaklarını karın ucundaki küçük açıklığa sokun ve kütikülü yanlamasına kesin. Bu, ventral kütikülün bir kenarını serbest bırakır. Flebi forseps ile kavrayın ve karnın karşı yan kenarı boyunca benzer bir kesim yapın. Ventral abdominal kütikülün serbest kalan flebi artık çıkarılabilir.

Bağırsak ve diğer karın organları genellikle kuyumcular, forseps ve hafif çekme kullanılarak tek bir kitle olarak çıkarılabilir. İç organların çıkarılması, hala küçük alary kasları ile dorsal kütiküle bağlı olan ve yağ cisimleriyle çevrili olan atan kalp tüpünü ortaya çıkarır. Çekilen kılcal damarlar, bir vakum kaynağına bağlı plastik, 1/16 inçlik boruya yerleştirilir. Emiş kuvveti uç çapı ile orantılıdır, bu nedenle çapı 40 mikrondan büyük olan pipetler kullanılmamalıdır.

Bir kez kurulduktan sonra, bu emme sistemi kalp tüpünün etrafındaki fazla yağı emmek için kullanılır. Kütikül çevresinde biriken hava kabarcıklarını ve herhangi bir kalıntıyı gidermek için de kullanılabilir. Kalbin kendisine dokunmaktan kaçınmak için son derece dikkatli olunmalıdır ve kalbin arka kısmı çok kırılgan olduğu için o bölgeden tamamen kaçınılmalıdır. Yetişkin Drosophila kalp tüpü artık açıkta ve atıyor olmalı.

Gerekirse, kütikül ve bağlı kalp, kütikülü vazelinden nazikçe kaldırarak ve tekrar kalp dokusuyla herhangi bir temastan kaçınarak dikkatlice geri sıkıştırarak yeniden konumlandırılabilir. Bu noktada, preparasyonu yıkayan çözelti taze, yapay hemolenf ile değiştirilmelidir. Bu preparatın, herhangi bir manipülasyondan önce oksijenasyon ile 20 ila 30 dakika dengelenmesine izin verilmelidir. Preparat 60 dakikadan daha uzun süre sürdürülecekse, taze yapay hemolenf ile tekrar perfüze edilmelidir. Bu preparat artık optik kayıt için kullanılmaya hazırdır ve ayrıca elektrofizyolojik kayıt veya histolojik manipülasyonlar için de kullanılabilir.