C. elegans Blastomer Diseksiyonu: Yumurta Kabuğunu Çıkarmak ve Embriyonik Hücreleri Ayırmak İçin Bir Yöntem

- Bu diseksiyon için iki mikropipet kullanın: biri yumurta ile yaklaşık olarak aynı genişlikte ve diğeri iki kat daha geniş bir açıklığa sahip ve aralarında hızlı transferi kolaylaştırmak için kuyucuklarda düzenlenmiş bir dizi çözelti.

İlk olarak, yetişkin hermafroditleri, embriyoların patlamasını önlemek için ozmotik olarak dengelenmiş yumurta tuzu çözeltisine yerleştirin. Gelişmekte olan embriyoları serbest bırakmak için solucanları ikiye bölün.

Ardından, iki hücreli aşama embriyolarını tanımlayın. Bu hücreler döllenmiş yumurtanın bölünmesi ile oluşan blastomerlerdir. Bir embriyoyu koruyucu yumurta kabuğunu parçalamaya başlayacak olan hipoklorit çözeltisine, ağartıcıya aktarmak için daha büyük açıklığa sahip mikropipeti kullanın.

Sadece 40 ila 55 saniye sonra, embriyoyu Shelton'un büyüme ortamına veya SGM'ye aktarın. Üçüncü bir kuyucuğa yerleştirmeden önce ağartıcının tüm izlerini gidermek için her embriyoyu iki SGM kuyusunda kısa bir süre yıkayın.

Şimdi, yumurta kabuğunu çıkarmak ve blastomerleri açığa çıkarmak için mekanik kuvvet sağlayan embriyoyu tekrar tekrar pipetlemek için daha küçük mikropipeti kullanın. Tek tek blastomer hücrelerini ayırmak için embriyoyu yavaşça pipetlemeye devam edin. Aşağıdaki protokolde, bu tekniği çalışırken göreceğiz.

- Bir mikrokılcal damarın her iki ucunu sağ ve sol elinizle 10 mikrolitre kapasitede tutun. Gerginlik uygulamak için mikrokılcal damarı her iki uca doğru çekin ve elle çekilmiş iki kılcal damar yapmak için kılcal damarın merkezini bir brülörün üzerine getirin.

Diseksiyon mikroskobu altında, elle çekilen kılcal damarların uçlarını forseps ile kesin. Embriyo transferi ve yumurta kabuğunun çıkarılması için C. elegans embriyolarının kısa eksen uzunluğunun sırasıyla yaklaşık iki katı ve bir katı olmak üzere iki uç açıklığı boyutunu yapın.

Çekilen kılcal damarı bir ağız pipetleme aparatına takın. 45 mikrolitre yumurta tuzu çözeltisini çok kuyulu bir slaytın kuyusuna pipetleyin.

Kuyuya 5 ila 10 yetişkin C. elegans yerleştirin. Erken C. elegans embriyolarını elde etmek için, C. elegans gövdesinin sağına ve soluna iki iğne yerleştirerek ve iğneleri birbirinin yanından kaydırarak yetişkinleri parçalara ayırın.

45 mikrolitre hipoklorit solüsyonunu, yumurta tuzu solüsyonu içeren kuyunun yanındaki bir kuyuya pipetleyin ve 45 mikrolitre Shelton büyüme ortamını sonraki üç kuyucuğa pipetleyin. Tek hücreli evre ve erken iki hücreli evre embriyoları, daha büyük boyutlu açıklıkla ağız pipeti ile hipokorit çözeltisine aktarın ve 40 ila 55 saniye bekleyin.

Embriyoları, ilk iki oyuğun her birinde 1 ila 2 saniye olacak şekilde Shelton'un büyüme ortamı ile sonraki üç oyuğa aktararak yıkayın. Daha küçük boyutlu bir açıklığa sahip elle çizilmiş kılcal damarı kullanarak, yumurta kabuğunun çıkarılması için embriyoyu dikkatlice pipetlemeyi tekrarlayın.

Bundan sonra, iki hücreli aşamalı embriyonik blastomerleri ayırmak için elle çizilmiş kılcal damar ile sürekli olarak pipetleyin.

- Yumurta kabuğu çıkarıldıktan sonra, patlamayı önlemek için embriyoları yukarı ve aşağı pipetleme kuvvetini en aza indirin.