JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Biyoloji
0 görüntülenme • 3:10 dk. • April 30th, 2023
- Gravid yetişkin solucanların ağartılmasıyla izole edilmiş peletlenmiş yumurtalarla başlayın. Kültürlenmiş hücrelerin kontaminasyonunu önlemek için bu prosedürün her adımının steril olarak yürütüldüğünden emin olun. Peletleri, yumurta kabuğunun yapısal bir bileşeni olan büyük bir polisakkarit olan kitini parçalayan bir enzim olan kitinaz çözeltisinde askıya alın.
Uygun bir sindirim periyodundan sonra, yumurtaları nazikçe santrifüjleyin ve sindirimi durdurmak için süpernatanı hücre kültürü ortamıyla değiştirin. Ardından, tek tek hücreleri mekanik olarak ayırmak için embriyoları 18 gauge bir iğneden geçirin. Ardından, yumurta kabuğundaki veya ayrılmamış hücre kümelerindeki kalıntıları temizlemek için çözeltiyi süzün. Hücreleri, fıstık aglütinini ile kaplanmış bir cam kapak astarı üzerindeki bir kültür kabına yerleştirin - hücre yüzeyi karbonhidratlarını bağlayarak hücrelerin kapak kaymasına bağlanmasına yardımcı olan bir lektin.
Örnek protokolde, embriyonik hücreleri in vitro morfolojik farklılaşma ve analiz için hazırlayacağız.
- Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için laminer bir akış başlığı altında çalışırken, peletlenmiş yumurtaları mililitre kitinaz başına bir mililitre ila iki miligram içinde yeniden süspanse edin ve bunları 15 mililitrelik taze bir konik tüpe aktarın. Enzimin tazeliğine bağlı olarak tüpü oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika sallayın. Yumurta kabuklarının yaklaşık% 80'i sindirildiğinde, yumurtaları 900 g'da üç dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra, üç mililitre L15 ortamı ekleyin. Yumurtaları altı santimetre çapında bir plakaya aktarın ve 18 gauge iğne ile 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanarak manuel ayrışmaya başlayın. Ayrışma derecesini izlemek için, taze bir Petri kabına bir damla süspansiyon koyun ve mikroskop altında görüntüleyin. Hücrelerin yaklaşık% 80'i ayrışana kadar devam edin.
Hücre kümelerini, sindirilmemiş yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları çıkarmak için, süspansiyonu beş mikronluk bir filtreden nazikçe süzün ve hücreleri geri kazanmak için filtreden dört ila beş mililitre L15 ortamı daha geçirin. Süzüntüyü 900 g'da üç dakika santrifüjledikten sonra hücreleri kültürlemek için, hücreleri tam L15 ortamında yeniden süspanse edin. Oyuk başına bir mililitre plaka yapın ve plakaları ortam havasında 20 santigrat derecede nemli, sızdırmaz bir odada saklayın.