C. elegans Kemotaksis Testi: Solucanlarda Kemosensasyonu Test Etmek İçin Bir Yöntem

- Karşılaşılan koşulları anlamlandırmak ve bunlara uygun şekilde yanıt vermek için, solucan C. elegans, diğerlerinin yanı sıra, çok çeşitli farklı kimyasalları tespit edebilen oldukça gelişmiş bir kemosensör sistemine sahiptir.

Kafadaki duyusal nöronlar, amphid ve iç labial nöronlar ve ayrıca kuyruktaki nöronlar, fazmid nöronlar, kütikül yoluyla doğrudan veya dolaylı olarak dış koşullara maruz kalır. Bu kemosensoriyel nöronlar, solucan tarafından uygun bir davranışsal yanıt üretmek için kullanılan ilgili bilgileri kodlar: kemotaksis adı verilen bir davranış.

Uçucu koku maddelerine veya tat verici suda çözünür ipuçlarına kemotaktik yanıtı test etmek için, istenen gelişim aşamasındaki solucanları izole edin ve bunları önceden hazırlanmış bir deneysel arenada test kimyasalına maruz bırakın. Bakteriyel bir besin kaynağı tarafından üretilenler gibi uygun kimyasallara maruz kaldığında, C. elegans kaynağa karşı pozitif kemotaksis gösterir.

Tersine, ağır metaller gibi daha az elverişli veya toksik kimyasallara maruz kaldığında, solucan kimyasaldan kaçınarak negatif kemotaksis gösterir. Bu nedenle, koku alma veya tat alma mutantları, caydırıcı kimyasallardan kaçınamaz ve caydırıcı durumdan kaçınan vahşi tip hayvanların aksine elverişsiz koşullarda kalır.

Örnek protokolde, solucanın bakıra karşı isteksizliğini test eden bir kemotaksis testinin bir gösterimini göreceğiz.

- Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın ve plakanın işaretli alt tarafını kılavuz olarak kullanarak, bir dış bakır bariyer oluşturmak için agarın kenarına 100 mikrolitre taze hazırlanmış 0.5 molar bakır iki sülfat çözeltisi pipetleyin. Bir orta hat bariyeri oluşturmak için 25 mikrolitre bakır iki sülfat çözeltisi pipetleyin.

Bakır iki sülfat çözeltisinin bakteri yaması ile temas etmediğinden emin olun ve bakır çözeltisinin plaka üzerinde kurumasını bekleyin. Transferden sonra her beş dakikada bir laboratuvar dokusu ile kuruluğu kontrol edin ve ayırt etmek için çözeltiyi plakanın kenarına yakın bir yere hafifçe vurun.

Tahlilden hemen önce, deney organizmalarını bakteri içermeyen bir agar plakasına aktarın ve fazla bakterileri uzaklaştırmak için nematodların bir dakika boyunca serbestçe hareket etmesine izin verin.

Daha sonra, solucanları bir mikrosantrifüj tüpüne yıkamak için 24 saat önce transfer edilen genç yetişkinlerle birlikte plakaya 1 mililitre M9 pipetleyin. Nematodları bir dakika boyunca 3.000 kez g'de santrifüjleyin.

Solucanlar tüpün dibinde bir pelet oluşturmalıdır. Solucan peletini bozmadan M9 solüsyonunu aspire edin. Solucan peletine 1 mililitre M9 çözeltisi ekleyin. Solucanları çözelti ile karıştırmak için tüpü ters çevirin.

Fazla bakteri başlangıçta solucanlarla birlikte aktarıldıysa, toplam beş kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, süpernatanı 100 mikrolitre M9 çözeltisi ve solucan peleti kalana kadar aspire edin. Yıkama adımları tamamlandıktan sonra solucanları hemen çözeltiden aktarın.

Tüpün altından 20 mikrolitre solucan peletini tahlil plakasının bakteri içermeyen yarısına pipetleyin. 10 solucanın tahlil plakasına aktarıldığından ve kontamine edici yiyecek bulunmadığından emin olun. Bakır gıda yarış plakalarına hiçbir bakteri aktarılmamalıdır.

Fazla M9 çözeltisini nematodlardan bir dakika içinde bir laboratuvar dokusu ile çıkarın. M9 çözeltisinin bakır iki sülfat çözeltisine temas etmediğinden ve solucanların ve agar yüzeyinin sağlam kaldığından emin olun. Laboratuvar dokusu ile yanlışlıkla çıkarılan solucanları atın.

M9 çözeltisi çıkarıldıktan ve tüm solucanlar sıvı olmayan lokomotor modellerine başladıktan sonra, yani harmanlanmayı bıraktıklarında, tahlil kronometresini başlatın. Yanlışlıkla fazladan solucanlar dahil edilmişse, plakaya bakteri eklenmediğinden emin olmak için halokarbon yağı ile toplayarak bunları çıkarın.

Test plakalarını her 30 dakikada bir kontrol edin. Bakteriyel yamaları olan tahlil plakaları için, dört saatlik bir süre içinde gıda yamasına ulaştıklarında organizmaları pozitif olarak puanlayın. Negatif kontrol plakaları için, bariyeri geçtiklerinde organizmaları pozitif olarak puanlayın.