C. elegans Hareket İzleme: Solucanlarda Hareketi Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

- C. elegans'taki hareketi değerlendirmek için, solucanların hareketini bir agar plakası üzerinde kaydetmek için bir kamera kullanın ve kayıt sırasında plakanın eşit şekilde aydınlatılmasını sağlayın. Solucanların plaka etrafındaki hareketini kısıtlamak için bakır halkalar kullanın. Bakır, C. elegans'a karşı caydırıcıdır, bu nedenle solucanlar halkaların içinde toplanır.

Her halkadaki solucanları aynı anda izlemek için bir plakaya birkaç bakır halka yerleştirin. Bu, kontrol ve deney hayvanlarının değerlendirilmesinin aynı koşullar altında yapılmasına olanak tanıyarak günlük değişkenliği azaltır ve yan yana karşılaştırmalara izin verir. Solucanların hareketini belirlenen zaman aralıklarında kaydedin ve hareket hızı ve kat edilen mesafe gibi lokomotif davranışının özelliklerini analiz etmek için bilgisayar yazılımı kullanın.

Örnek protokolde, alkolün solucanın hareket hızı üzerindeki etkilerini test eden bir hareket izleme testinin bir gösterimini göreceğiz.

- Başlamak için, her deney grubundan 10 solucanı bir iklimlendirme plakası üzerindeki bakır bir halkanın merkezine aktarmak için iki dakika veya daha kısa bir süre ayırın. Bu etanol içermeyen bir plaka. Hareketlerini azaltacağı için solucanlarla yiyecek aktarmaktan kaçının. Ayrıca agar yüzeyine zarar vermekten kaçının çünkü solucanlar yuva yapacaktır. Plakaya yükleme süresini kaydedin ve solucanların her bir plakaya transferini iki dakikadan fazla kademelendirdiğinizden emin olun, böylece her bir plaka uygun zaman aralığında ayrı ayrı filme alınabilir.

Her bir iklimlendirme plakasının oda sıcaklığında 30 dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, solucanları iklimlendirme plakasına yerleştirmek için kullanılan sırayı takip ederek solucanları tahlil plakasına aktarın. Bakteri içermeyen ince kenarlı düzleştirilmiş bir solucan penası kullanarak, bir kepçe hareketi kullanarak solucanları düzleştirilmiş penanın üzerinde toplayın. Ardından, etanolün buharlaşma kaybını en aza indirmek için plakayı laboratuvar filmi ile kapatın.

- Hayvanların bu aşamada transfer edilme hızı çok önemlidir, çünkü transfer edilen hayvanlar etanole daha uzun süre maruz kalacaktır. Bu nedenle, deneysel kopyalar arasında plakaya ilk olarak hangi suşların yerleştirildiğini döndürmek iyi bir fikirdir.

- Artık solucanları filme almak için yüksek çözünürlüklü video kameralı bir mikroskop gerekiyor. Üç inç kare arka ışık gibi aydınlatma bile analiz için hayati önem taşır. Ardından, kontrastı korumak için plaka ortamı tarafı yukarı bakacak şekilde görüntüleyin.

Saniyede bir karede 120 kare, 12 bit, gri tonlamalı, zaman atlamalı filmler çekmek için görüntü analiz yazılımını hazırlayın. Çıktı dosyasının boyutunu küçültmek için, yeterli görüntü çözünürlüğünü korurken, ikiye iki gruplama modunu kullanın.

Şimdi her plakadan, son solucanlar o plakaya yerleştirildikten 10 dakika sonra iki dakikalık filmler kaydedin. Ardından, solucanlar plakaya yerleştirildikten 30 dakika sonra iki dakikalık ikinci bir kayıt yapın. Bu gösterim için Image-Pro Plus yazılımı kullanılır, çünkü çok çeşitli başka yazılımlar tekniğe uyarlanabilir. Filmleri iki dakikalık bölümler halinde analiz edin.

İlk olarak, görüntülere arka planı düzleştiren ve solucan nesnelerinin kontrastını artıran bir filtre uygulayın. Menü altında İşlem'i, ardından Filtreler'i, ardından Geliştirme'yi ve ardından Düzleştir'i seçin. Koyu bir arka plan ve 20 Pix özellik genişliği için parametreyi ayarlayın.

Şimdi, her bir halkadaki hayvanların hareketini, bakır halkayla örtüşen dairesel bir ilgi alanı ile ayrı ayrı analiz edin. Measure (Ölç) alt menüsü altında yer alan Track Objects (Nesneleri İzle) komutu ile solucanları tanımlayın ve takip edin.

İzleme Verileri Tablosu penceresinde, belirli parçaların hariç tutulmasına izin vermek ve deneysel yapıları sınırlamak için İzleme Seçenekleri düğmesini kullanın. Otomatik İzleme sekmesi altında, izleme parametrelerini kare başına 400 mikronluk bir hız sınırına ayarlayın. Hızlanma sınırını Otomatik olarak ayarlayın.

Minimum Toplam İz Uzunluğu'nu 400 mikron olarak ayarlayın ve Baskın Hareket Türü'nü Kaotik olarak ayarlayın. Ardından İzleme Parametresi altında, nesneleri Kısmi İzlerin en az 21 kare uzunluğuna ve bir kare İzleme Projeksiyon Derinliğine sahip olacak şekilde ayarlayın.

Şimdi, izleme işlemini başlatmak için önce Tüm Parçaları Otomatik Olarak Bul işlev düğmesine tıklayın. Bu, Sayım/Boyut Seçenekleri iletişim kutusunu ve İzleme İletişim kutusunu getirir. Count/Size (Sayım/Boyut) iletişim kutusunda Intensity Range (Yoğunluk Aralığı Seçimi) için Manual (Manuel) seçeneğini belirleyin. Bu önemli bir eşik adımı sağlar. Ardından, karanlık nesneleri vurgulayan kapsayıcı bir aralık oluşturmak için Yoğunluk Eşiği kaydırıcılarını ayarlar. Ölçekte iyi bir başlangıç noktası 0 ile 1.500 arasındadır.

Şimdi, tek bir solucandan daha büyük veya daha küçük nesneleri dışlamak için bir boyut filtresi uygulayın. Ölçü menüsüne gidin ve ardından Ölçü alt menüsünü seçin. Bu, Sayı/Boyut seçenekleri iletişim kutusunu açar. Orada, alan aralığını 28.000 ila 120.000 mikron kare olarak ayarlayın. Ve çevre aralığını 600 ila 2.500 mikron olarak ayarlayın. Anormal boyutta solucanlar kullanırken bu parametrelerde ayarlamalar yapın.

Şimdi, izleme iletişim kutusunda Devam'ı tıklatarak izleme işlemini tamamlayın. Çıktının film çekimiyle birlikte izlenip izlenmediğini iki kez kontrol edin. Filtrelemek için açık bir neden olmadıkça her solucanın temsil edildiğinden emin olun. Ardından, solucan olmayan nesneler tarafından üretilen parçaları manuel olarak silin.

Ardından, her kare veya her saniye arasında kat edilen mesafenin ortalamasını alarak her bir solucanın hızını hesaplayın ve her popülasyondaki izler için ortalama bir hız oluşturun. Bu son ortalamayı, deneyin istatistiksel analizi için bir örnek noktası olarak düşünün.