Epidermal Lazer Yarası: C. elegans'ta Onarım Süreçlerini İncelemek İçin Lokalize Hasara İndükleme

- Başlamak için, genç yetişkin solucanları bir slayt üzerindeki taze bir agaroz pedine aktarın. Daha sonra solucanları felç etmek için birkaç damla 12 milimolar levamisol çözeltisi ekleyin. Solucanları bir lamel ile örtün ve birkaç dakika bekleyin. Slaytı dönen bir disk konfokal mikroskobunun altına yerleştirin ve solucanın en yan dış yüzeyine odaklanın.

Yetişkin bir solucanın epidermisi, hücre füzyon olaylarından kaynaklanan çok çekirdekli sinsitlerden oluşan ince, tek katmanlı bir yapıdır. Epidermisin apikal yüzeyi esnek bir kollajen kütikül salgılarken, bazal yüzey bazal lamina adı verilen ince bir hücre dışı matris tabakası ile kaplıdır.

Daha sonra, epidermisin apikal yüzeyini bir lazerle yaralayın. Hasarlı hücrelerden gelen sitoplazma, yara bölgesinde bir kabarcık olarak ortaya çıkarak dışarı sızabilir.

Lazer ışınlama, iç dokulara zarar vermeden kütikül ve epidermal hücrelerin lokalize bozulmasına neden olduğu için iğne yaralama gibi diğer tekniklere göre bir avantaja sahiptir. Örnek protokolde C. elegans'ta lazerle yaralama işlemini göreceğiz.

- Nematodları hassas bir şekilde sarmak için bu protokol, dönen disk konfokal mikroskobuna bağlı bir femtosaniye lazer kullanır. İki fotonlu mikroskoplarda olduğu gibi femtosaniye lazerler kullanılarak yapılan çizgi veya nokta taramaları da yeterli olmalıdır.

- Bir agar pedi üzerinde 10 genç yetişkin toplayarak başlayın. Onları iki mikrolitrelik 12 milimolar levamisol çözeltisi damlasında felç edin. Daha sonra üzerlerini bir örtü ile örtün ve felç olana kadar birkaç dakika bekleyin.

- Bir hayvanın tamamen felç olması şarttır. 12 milimolar levamisol yara yanıtını etkilemez. Bununla birlikte, diğer immobilizasyon yöntemleri de kullanılabilir.

- Femtosaniye lazer gücünün, hedeften önce ölçüldüğü gibi 140 miliwatt'a ayarlandığından ve lazer tekrarlama oranının 80 megahertz'de olduğundan emin olun. Şimdi, dönen bir disk konfokal mikroskobu altında solucanları bulun. Yüksek sayısal açıklığa sahip 100x'lik bir objektif kullanarak, hedef solucanın lateral anterior veya posterior sinsityal epidermisine odaklanın.

Epidermal hücrenin apikal yüzeyine odaklanarak, lazeri 20 milisaniye ile ayrılmış iki adet 200 milisaniyelik darbeye kadar parlatın. Bu epidermisi yaralamak için yeterli olmalıdır. Bir dakika bekleyin ve köpürme olarak görünecek olan sitoplazmanın lokal bozulmasını gözlemleyin. Bir floresan belirteç varsa, lokalize ağartma gözlenebilir.