UV Işınlaması: Kromozomal Dışı Dizileri Entegre Etmek İçin Bir Yöntem

- Transgenik solucan suşları oluşturmanın en basit yöntemi olan mikroenjeksiyon ile ekstrakromozomal DNA dizileri oluşturmak, hücre bölünmesi sırasında stabil bir şekilde iletilmeyen ve bu nedenle değişken kalıtım oranları ve ekspresyon seviyeleri sergileyen genetik elementlerle sonuçlanır. Diziyi bir kromozoma entegre etmenin amacı, bu genetik kararsızlığı ve değişkenliği azaltmaktır.

Bunu yapmak için, daha önce mikroenjeksiyonla tanıtılan ekstrakromozomal bir dizi taşıyan ve onların gravid yetişkinlere dönüşmelerine izin veren, yaşla senkronize edilmiş bir L4 transgenik solucan popülasyonu ile başlayın. Bu yetişkinleri yeni tabaklara aktarın ve her tabakta en az 30 yumurta olana kadar yumurtlamalarına izin verin. Yetişkinleri çıkarın ve yumurtaların L4 aşamasına ulaşana kadar büyümesine izin verin. Ardından, solucanları UV ışığı ile ışınlayın. Bu, genomik DNA'da rastgele çift iplikli kırılmalara neden olur, burada solucanların DNA onarım mekanizması diziyi keyfi olarak dahil edebilir.

Bir gecelik iyileşme döneminden sonra, hayatta kalan solucanların sayısını sayın. Ölü solucanların küçük bir yüzdesi verimli ışınlamayı gösterir. Homozigot entegre transgenik hatları izole etmek için sonraki nesilleri gözlemleyin. Örnek protokolde, farenkste eksprese edilen bir floresan ko-enjeksiyon markörü taşıyan yüksek iletim hızına sahip bir ekstrakromozomal diziyi entegre edeceğiz.

- Entegre edilecek transgenik hattın iletim hızını değerlendirin. Her transgenik hat için, bir floresan stereoskop altında 10 ayrı kültür plakasına 10 floresan gravid ergini seçin. Hayvanları, genetik arka planın üremesine izin veren bir sıcaklığa ayarlanmış bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin.

Ko-enjeksiyon belirtecinin hangi gelişim aşamasını ifade ettiğini ve en iyi şekilde gözlemlenebileceğini değerlendirmek için her gün dölleri izleyin. Floresan stereoskopi kullanarak, floresan döl yüzdesini belirleyerek döllerin iletim hızını değerlendirin. Transgen entegrasyonu için, en yüksek iletim hızına sahip transgenik hattı seçin.

Entegrasyon için L4 larva aşamasında senkronize edilmiş bir transgenik hayvan popülasyonu elde edin. Beş kültür plakasına 30 floresan gravid yetişkin seçin. Solucanlar 15 santigrat derecede üç ila dört saat boyunca yumurta bıraktıktan sonra, tabakta en az 30 yumurta olup olmadığını kontrol edin ve ardından yetişkinleri plakalardan çıkarın.

Döller L4 larva aşamasına ulaşana kadar hayvanları bir solucan kuluçka makinesinde kültürleyin. 15 ila 20 floresan transgenik L4 hayvanı içeren her bir plakayı, kapakları çıkarılmış olarak bir UV çapraz bağlayıcıya yerleştirin. Solucanları ışınlayın.

İyileşme için, ışınlanmış solucanları gece boyunca 15 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Canlı olan hayvan sayısını kontrol edin. Elimizde, yaklaşık %80 ila %90 arasında bir hayatta kalma oranı, verimli bir ışınlama için uyarlanabilir. Işınlanmış hayvanları, döller gelişim aşamasına ulaşana kadar 15 ila 25 santigrat derecede büyütün ve ko-enjeksiyon işaretleyici ifadesinin gözlemlenmesine izin verin.