JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:22 dk • April 30th, 2023
- Başlamak için, insan lösemi hücrelerini taze hazırlanmış bir kültür ortamında tohumlayın ve istenen süre boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bu hücre süspansiyonunun küçük bir miktarını tripan mavisi ile boyayın ve bir TC20 hücre sayaç lamı kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. Ölü hücreler geçirgendir ve negatif yüklü boyayı alırken, canlı hücreler geçirimsizdir.
Daha sonra, hücrenin kolesterolünü yeterince tüketmek için kültür şişesine metil beta siklodekstrin ekleyin ve bu da onları ultrasona duyarlı hale getirir. Hücreleri istenen süre boyunca inkübe edin. Hücre sonikasyon sistemini deiyonize su ile doldurun ve vakum kabarcıklarını önlemek için birkaç dakika gazdan arındırın. Sintilasyon şişesinde istenen miktarda hücreyi aktarın ve şişeyi hücre sonikasyon sisteminin tutma cihazına takın.
Tutma cihazını kornanın üzerine yerleştirin ve kornanın üstünden istenen yüksekliği ayarlayın. Hücreleri sonikasyon yapmak için istenen süre boyunca gerekli darbeleri ayarlayın. Hücre süspansiyonuna tripan mavisi ekleyin ve hücre canlılığını ve hasarını analiz etmek için TC20 hücre sayacına yerleştirin. Metil beta siklodekstrin ile tedavi edilen lösemi hücreleri, düşük frekanslı ultrasona maruz kaldıklarında önemli hücre lizizi gösterir.
Aşağıdaki protokolde, insan lösemi hücrelerinin hücre sonikasyonu ve hasar değerlendirmesini inceleyeceğiz.
- Hücreleri sonikasyon için hazırlamak için, önce taze hazırlanmış ortam kullanarak 25 santimetre karelik bir şişede mililitre başına 4 kez 10 ila dördüncü hücrelere tohumlayın. Tripan mavisi dışlaması ile canlı hücrelerin sayısını belirledikten sonra, kültür istenen konsantrasyona ulaşana kadar kültürü 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücreler sonikasyon için hazır olduğunda, bir hacim iyonize damıtılmış suyun gazını almak için bir vakum ve Buchner şişesi kullanın. Ardından, fincan kornasını kornanın üst kısmından 15 milimetreye kadar doldurmak için suyu kullanın.
Sistemi gazı alınmış su ile yaklaşık yedi dakika çalıştırın, daha sonra 3 mililitre hücreyi 20 mililitrelik bir cam parıldama şişesine aktarın ve şişeyi tutma cihazına takın. Ardından, tutma cihazını fincan boynuzunun üst kısmına takın ve tutma cihazını su yüzeyindeki boynuzun tepesinden 15 milimetre yüksekliğe ayarlamak için kaydırma mekanizmasını kullanın. Şimdi, darbelerin her biri arasında% 33 ve% 50 genlikte bir saniyelik bir boşluk ile üç adet bir saniyelik ultrason darbesi kullanarak hücreleri sonikleştirin.
Tripan mavisi dışlaması ile sonikasyondan sonra hücre canlılığını değerlendirin. Hücre hasarını değerlendirmek için, bir Z2 partikül analizörünün açıklığını en az 2 kez izotonik tuzlu su ile yıkayın. Daha sonra, 20 mililitre izotonik salin içine 100 mikrolitre sonikasyonlu hücreler ekleyin ve hücre örneğini sayaç tutucusuna aktarın. Ardından platformu açıklığa kaldırın ve hücre hasarını, canlılığını ve kalıntılarını üreticinin talimatlarına göre analiz edin.