XTT Testi: Hücre Canlılığını ve Mitokondriyal Aktiviteyi Değerlendirmek için Kolorimetrik Bir Test

- Düşük frekanslı ultrason dalgaları, insan lösemi hücrelerinin seçici lizisine yol açar ve XTT testi bu hasarın derecesini belirlemeye yardımcı olur. Tahlil, sağlıklı hücrelerin mitokondriyal enzimlerinin sarı bir XTT boyasını formazan adı verilen turuncu bir bileşiğe dönüştürmesi prensibine göre çalışır. Tahlillere başlamak için, hücreleri kolesterol tüketen bir ajan olan metil beta-siklodekstrin ile tedavi edin ve ardından hücre hasarını indüklemek için hücreleri düşük güçte sonikleştirin.

Hücreleri peletlemek için santrifüjleyin ve pelete taze hücre büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri istenen konsantrasyonda çok kuyulu bir mikroplakaya tohumlayın ve gece boyunca inkübe edin. Şimdi, aktive edilmiş XTT çözeltisini hücrelere ekleyin ve mikroplakanın kuyucuklarında turuncu renk gelişene kadar inkübe edin. Plakayı bir spektrofotometreye yerleştirin. Absorbansı 450 ila 500 nanometrede ve ardından 630 ila 690 nanometrede ölçün. Kesin sonuçlar elde etmek için iki değeri çıkarın. XTT tahlilinde daha yüksek absorbans değeri, mitokondriyal enzimlerin daha yüksek aktivitesini ve daha yüksek hücre canlılığını gösterir.

Aşağıdaki videoda, metil beta siklodekstrin ile tedavi edilen lösemi hücrelerinde hücre hasarına neden olmak için düşük frekanslı ultrason dalgalarının etkinliğini belirlemek için XTT testinin kullanımını göstereceğiz.

- XTT testi ile sonikasyonlu hücrelerin canlılığını değerlendirmek için, XTT kitinin değerlendirmesi için bir dizi hasar geliştirmek için bir saniye arayla bir ila üç bir saniyelik darbe aralığı kullanarak hücreleri sonikleştirin. Daha sonra hücreleri aşağı doğru döndürün ve peletleri taze hazırlanmış büyüme ortamında mililitre başına 1 çarpı 10 ila beşinci hücreye kadar yeniden süspanse edin. Daha sonra, boş absorbans okumaları için tek başına 100 mikrolitre tam büyüme ortamı içeren üç kontrol kuyusu da dahil olmak üzere, üç kopya halinde ayrı ayrı düz tabanlı 96 kuyulu mikrotitre plakalarına 100 mikrolitre hücre tohumlayın. Hücreleri 24 saat inkübe edin.

Tahlil sabahı, 37 santigrat derece ısıtılmış XTT'nin alikotlarını ve aktivasyon reaktiflerini, çözeltiler berraklaşana kadar hafifçe döndürün. Ardından, XTT reaktifinin 5 mililitrelik bir alikotuna 0.1 mililitre aktivasyon reaktifi ekleyin. Daha sonra, U937 ve THP1 ile aşılanmış plakaların her bir oyuğuna 50 mikrolitre aktive edilmiş XTT çözeltisi ekleyin ve hücreleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. İki saat sonra, turuncu boyayı pozitif oyuklara eşit olarak dağıtmak için plakaları hafifçe sallayın ve 450 ila 500 nanometre arasında bir mikrotitre plaka okuyucusundaki emiciliği ölçün. Son olarak, tüm tahlil kuyularının absorbansını tekrar 630 ila 690 nanometre arasında ölçün.