$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- İstenilen hücre yoğunluğunu içeren bir lösemi hücre süspansiyonu ile başlayın. Hücreleri serum içeren bir kültür ortamında santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. Serum ilavesi sürekli hücre büyümesini teşvik eder ve hücreler farklı hücre döngüsü aşamaları boyunca hareket eder. Hücreleri bir bromodeoksiuridin veya BrdU etiketleme çözeltisi içinde seyreltin ve gerekli süre boyunca fizyolojik koşullar altında büyütün.
Sentez veya S fazındaki hücreler, DNA replikasyon işlemi sırasında timidinin yerini alan bir timidin analoğu olan BrdU'yu alır. Fazla BrdU'yu çıkarmak için hücreleri santrifüjleyin ve hücreleri uygun bir ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri çok oyuklu bir plakaya aktarın. Hücrelerin farklı zaman dilimleri için fizyolojik koşullar altında büyümesine izin verin.
Çeşitli zaman periyotlarında, hücreler S, G2, mitoz ve G1 fazlarının geri kalanı boyunca ilerler ve bir sonraki hücre döngüsüne girerek hücre proliferasyonunun tahmin edilmesine izin verir. BrdU'yu florokrom antikoru ile etiketlemek için antikor boyaması yapın ve akış sitometrisi kullanarak hücre proliferasyonunu ölçün.
Akış sitometresinin içinde, florokromlar lazer enerjisini emer ve floresan verir. Çoğalan hücrelerin sayısı, gözlemlenen floresan ile doğrudan ilişkilidir. Örnek protokolde, akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin nabız etiketlemesini göstereceğiz.
- Bu protokol akut lenfoblastik lösemi hücre hattı olan NALM6'yı kullanır, ancak yapışık olmayan herhangi bir hücre hattına uygulanabilir. T-6 kültür şişelerindeki NALM75 hücrelerini, havadaki% 5 karbondioksitte 37 santigrat derecede tam RPM'de tutun. Hücreleri topladıktan ve bir hücre sayımı yaptıktan sonra, hücreleri mililitre başına 2 kez 10 ila 6 hücre arasında tam RPM'de yeniden askıya alın
.
Mililitre başına 1 kez 10 ila 6 hücrelik bir nihai hücre konsantrasyonu üretmek için hücreleri 2'de 1 oranında BrdU Tam RPMI ile seyreltin. Potansiyel bir mutajen ve teratojen olduğu için BrdU'yu dikkatli kullanın. 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 45 dakika inkübe edin.
Ardından, hücreleri Tam RPMI ile 10'da 1 oranında seyreltin. Beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjleyin ve tüm süpernatanı dikkatlice atın. Hücreleri küçük bir Tam RPMI hacminde yeniden askıya alın, bir hücre sayımı yapın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1 kez 10 ila 6 hücreye ayarlayın. 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mililitre hücre pipetleyin.
Daha tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için 1 mililitre DPBS'yi boş kuyucuklara pipetleyin. Deneysel tasarımın neyi ölçmeyi amaçladığına bağlı olarak, istenen zaman noktaları için havada% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, tüm hücreleri FACS tüplerine aktarın.
Her bir kuyucuğu 1 mililitre hacimde PBS ile toplam 5 mililitre hacme kadar durulayın. Beş dakika boyunca 150 kez G'de santrifüjleyin ve tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücreler artık hemen yapılması gereken boyama için hazırdır. Yüzey boyama gerekiyorsa, fiksasyondan önce şimdi yapılmalıdır.