BrdU İmmünofloresan Boyama: Hücre Döngüsünün Farklı Aşamalarındaki Hücreleri Tanımlamak İçin Bir Teknik

- Bromodeoksiüridin veya BrdU, sentetik bir timidin nükleosit analogudur. Hücre döngüsünün sentez aşaması sırasında, BrdU timidinin yerini alır ve yeni sentezlenen DNA'ya entegre olur. Dahil edilmiş BrdU, hücre döngüsü ilerlemesinin izlenmesine izin verir. Dahil edilmiş BrdU'yu tespit etmek için, önce, hücreleri geçirgen hale getirmek için sabitleyin ve geçirgen hale getirin.

Daha sonra, DNA zincirlerini parçalamak ve dahil edilen BrdU'yu açığa çıkarmak için hücreleri DNAse enzimi ile tedavi edin. Daha sonra, uygun bir floresan etiketli anti-BrdU antikoru ekleyin. Antikor çekirdeğe girer ve DNA'da bulunan açıkta kalan BrdU'ya kolayca bağlanır.

Ek olarak, hücreleri uygun bir floresan DNA bağlayıcı boya ile tedavi edin. Boya, DNA'ya bağlanarak toplam DNA içeriğinin ölçülmesine izin verir. Hem etiketli BrdU hem de DNA'dan gelen floresansı tespit etmek için akış sitometrisi kullanın.

Etiketli DNA'dan gelen floresan yoğunlukları, toplam DNA içeriğindeki varyasyona bağlı olarak hücreleri farklı hücre döngüsü fazlarında farklılaştırır. BrdU'dan gelen floresan sinyali, BrdU içeren hücrelerin mevcut hücre döngüsü konumunu tanımlar.

Bu örnekte, akut lenfoblastik lösemi hücreleri olan NALM-6'nın BrdU immünofloresan boyamasını gerçekleştireceğiz.

- Antikor boyamadan önce, hücreleri DNAse ile tedavi edin. Hücreleri 100 mikrolitre DNAse çözeltisinde yeniden süspanse edin ve 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Bir mililitre yıkama tamponu ekleyin, hücreleri santrifüjleyin ve süpernatanı atın. BrdU dışındaki hücre içi belirteçler için antikor boyama, BrdU boyaması ile eş zamanlı olarak gerçekleştirilebilir.

- Boyanmamış hücrelerden ve her bir florokrom ile etiketlenmiş hücrelerden oluşan kompanzasyon kontrollerinin hazırlanması önemlidir. İdeal olarak, kompanzasyon kontrolleri için deney tüplerinde kullanılanlarla aynı antikorları kullanın.

- Hücreleri, 6 hücreli BrdU antikoruna 10 başına bir mikrolitre ile 50 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden süspanse etti. Diğer spesifik hücre içi antijenlere karşı antikorlar kullanılıyorsa, bu noktada eklenmelidir. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

20 dakika sonra, hücreleri daha önce gösterildiği gibi bir mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Son olarak, hücre döngüsü analizi için DNA'yı boyayın. Tüpü hafifçe vurarak peleti gevşetin ve 20-AAD solüsyonundan 7 mikrolitre ekleyin. Hücre başına sabit miktarda 7-AAD kullanmak çok önemlidir. Hücreleri bir mililitre boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, akış sitometrisi analizi yapın.