Lösemik Hücrelerin BMSC'lerle 2 Boyutlu Ko-kültürü: Lösemik Hücrelerin Alt Popülasyonlarını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

- Bir 2D ko-kültür sisteminde, birden fazla hücre tipi düz kültür plakalarında birlikte büyütülür. Bu kültür sistemi, in vitro hücre etkileşimlerinin ve davranışının incelenmesini kolaylaştırır. Kemik İliği Stromal Hücreleri veya BMSC'ler ile lösemik hücre ko-kültürü oluşturmak için, BMSC'lerin yapışkan bir tek katmanlı kültürüne lösemik hücre süspansiyonu ekleyin. Plakayı uygun kültür koşulları altında inkübe edin. Her dört günde bir kültür ortamının %90'ını değiştirerek ortak kültürü koruyun.

Bu 2D ko-kültür sırasında, lösemik hücreler BMSC'lerle etkileşime girer ve kültürdeki farklı bölgelere lokalize olur ve üç alt popülasyon oluşturur. Faz kontrast mikroskobu, üç alt popülasyonun görsel olarak ayırt edilmesini sağlar. Ortamda serbestçe yüzer görünen ilk lösemik hücre grubu, askıya alınmış hücreler olarak kategorize edilir. BMSC tek tabakasının yüzeyine yapışmış olan ikinci lösemik hücre grubu parlak görünür ve faz parlak hücreler olarak kategorize edilir.

Tek tabakanın altına göç eden üçüncü grup lösemik hücreler sönük görünür ve faz-dim hücreler olarak kategorize edilir. Aşağıdaki protokolde, Akut Lenfoblastik Lösemi veya ALL hücrelerinin insan kemik iliği stromal hücreleri ile ko-kültürünü gerçekleştiriyoruz.

- 10 mililitre tümöre özgü kültür ortamında 5 ila 20 kez, 10 ila altıncı lösemik hücreleri,% 80 ila% 90 birleşik kemik iliği, stromal hücreler veya osteoblastlardan oluşan 100 milimetrelik bir plakaya tohumlayarak başlayın. Her dört günde bir, plakayı yana doğru eğin ve yapışan hücre tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek ortamın 1 mililitresi hariç hepsini aspire edin. Daha sonra, yapışan hücrelerin minimum düzeyde bozulmasını sağlamak için 9 mililitre taze lösemik hücre kültürü ortamını yan taraftaki plakanın köşesine damla damla dikkatlice ekleyin.

Ko-kültürün 12. gününden sonra, yüzen lösemik hücreleri toplamak için kültür ortamını plaka üzerinde yaklaşık 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Daha sonra, hücreleri, az önce gösterildiği gibi% 80 ila% 90 birleşik kemik iliği stromal hücreleri veya osteoblastlardan oluşan yeni bir plakaya yeniden tohumlayın. 4. güne kadar, lösemik hücrelerin üç alt popülasyonu oluşmuş olacak, askıda kalan lösemik hücreler ortamda serbestçe yüzer, faz parlak lösemik hücreler yapışık hücre tek tabakasının yüzeyine yapışır ve faz karartılmış lösemik hücreler monotabakanın altına göç eder.