Lösemik Alt Popülasyon Hasadı: Lösemik Hücre Alt Popülasyonlarının 2D Ko-kültürden Mekansal Olarak Ayrılması İçin Bir Yöntem

- Lösemik hücreler mezenkimal stromal hücrelerle birlikte kültürlendiğinde, stromal hücrelerle etkileşime girerler ve üç alt popülasyon oluştururlar. Serbestçe yüzen askıda hücreler, mezenkimal tek tabakanın yüzeyine yapışan faz parlak hücreler ve mezenkimal tek tabakanın altındaki faz karartma hücreleri. Her bir alt popülasyonu ayırmak için, mezenkimal stromal hücreli tek tabakalı bir doku kültürü plakası alın.

Tümöre özgü kültür ortamında bulunan lösemik hücreleri tek tabaka üzerine tohumlayın ve plakayı istenen süre boyunca inkübe edin. Daha sonra, serbestçe yüzen hücreleri ayrı bir tüpe pipetleyerek tümör hücrelerini süspansiyon halinde toplayın. Şimdi, taze ortamı plakaya ekleyin ve faz parlaklığında tümör hücrelerini mezenkimal tek tabaka yüzeyinden çıkarmak için kuvvetlice pipetleyin.

Bu hücreleri ayrı bir tüpte pipetleyerek toplayın. Yapışan mezenkimal hücreleri çıkarmak için plakaya tripsin ekleyin. Tripsinin etkisini durdurmak ve hücre agregalarını parçalamak için fetal sığır serumu veya FBS ekleyin. Şimdi, faz karartma hücrelerini bir tüpte toplayın. Farklı hücre alt popülasyonları içeren üç tüpü de ayrı ayrı santrifüjleyin ve daha fazla analiz için peleti taze ortamda yeniden süspanse edin. Aşağıdaki protokolde, süspansiyon, faz parlak ve faz karartılmış lösemik hücreleri 2D ko-kültürden izole edeceğiz.

- Askıya alınmış tümör alt popülasyonunu hasat etmek için, ortamı lösemik hücre ko-kültür plakasından aspire edin ve plakayı bir kez nazikçe durulamak için aynı ortamı kullanın. Daha sonra, yüzen süspansiyon lösemik hücreler alt popülasyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Faz parlak tümör alt popülasyonunu hasat etmek için, ko-kültür plakasına 10 mililitre taze ortam ekleyin

ve yapışık hücre tek tabakasını yerinden çıkarmadan yapışık lösemik hücreleri çıkarmak için yaklaşık beş kez yeterince kuvvetlice durulayın. Ardından, faz parlaklığında alt popülasyonu kendi 15 mililitrelik konik tüpüne aktarın. Faz karartıcı tümör alt popülasyonunu hasat etmek için, kalan ortamı bir mililitrelik PBS durulama ile çıkarın ve hücreleri 37 santigrat derecede üç mililitre tripsin ile ayırın.

Beş dakika sonra, yapışan hücreleri çıkarmak için plakanın kenarlarına hafifçe vurun, ardından enzimatik reaksiyonu durdurmak için bir mililitre FBS ekleyin. Daha sonra, herhangi bir büyük hücre agregatını parçalamak için serumu üç ila beş kez durulayın ve saflaştırılmamış faz-dim alt popülasyonunu yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüm alt popülasyonlar toplandığında, hücreleri aşağı doğru döndürün ve peletlerin her birini bir mililitre önceden ısıtılmış ortamda yeniden süspanse edin.